Принципи пошуку мутацій

Загальний підхід до пошуку мутацій в геномній ДНК людини базується на ряді принципів.

Використання того чи іншого методу в ДНК-діагностики залежить від наявності інформації про можливе типі мутації у даного пацієнта. У тих випадках, коли тип мутації невідомий, застосовуються скринінгові методи, що дозволяють виявляти будь-які відхилення в нуклеотидної послідовності мутантного і нормального генів. Eсли ж мутація відома, наприклад вже ідентифікована у родичів, для обстеження використовуються інші, більш прості

і водночас більш ефективні методи, які можна назвати методами детекції відомих мутацій.

Далі, незалежно від спрямованості (скринінговий або детекціонний) обраного способу обов’язково враховують, що одна група методів базується на специфічності нуклеотидного спарювання при утворенні подвійного ланцюга ДНК, а інша – на впізнаванні послідовності ДНК ферментами.

Для першої групи методів в якості референсной послідовності використовуються фрагменти послідовності досліджуваного гена, що відповідає дикому типу, т. Е. Найбільш поширеною в популяції. Це може бути як короткий олігонуклеотидний праймер (близько 20 нуклеотидів), так і більш довгий фрагмент ДНК, який використовується для гібридизації. У тому випадку, якщо ДНК хворого містить мутацію в ділянці, перекривають пробою, повноцінна гібридизація між мутантним алелем і пробою неможлива. Це призводить або до відсутності продукту полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), або до утворення неповноцінного ДНК-дуплекса, що містить ділянки неспарених нуклеотидів, які виявляються різними хімічними або ферментативними способами.

Класичним прикладом методу, заснованого на впізнаванні послідовності ДНК ферментами, є використання рестриктаз – ферментів, що розщеплюють ДНК в ділянках, що містять строго індивідуальні послідовності довжиною 4-8 нуклеотидів. Поява відхилень у нуклеотидної послідовності в результаті мутації може приводити або до втрати вже існуючого сайту розщеплення для будь-якої рестріктази, або, навпаки, до його появи. У цій же групі методів використовують ферменти ДНК-полімерази. Ці ферменти синтезують комплементарную ланцюг в точній відповідності з послідовністю одноцепочечной матриці. Використовуючи мічені нуклеотидні блоки, можна визначити, в якій послідовності розташовуються нуклеотиди в даній матриці. Такий принцип лежить в основі ферментативного секвенування (визначення нуклеотидної послідовності) за методом Сенгера, а також в його спрощених варіантах, призначених для визначення нуклеотидної послідовності коротких ділянок ДНК (мінісеквенірованіе).

У переважній більшості випадків перед власне аналізом мутацій досліджуваний фрагмент генома пацієнта амплифицируют за допомогою ПЛР. Метою ПЛР зазвичай є просте множення числа копій даного фрагмента, що полегшує технічно подальший аналіз ДНК (рис. 4.3). У більшості варіантів ПЛР у гетерозигот з однаковою ефективністю амплифицируют і нормальний, і мутантний аллели, а їх дискримінація здійснюється на наступних стадіях. Існує також аллель-специфічна ПЛР, при якій використовуються праймери, гомологічні нормальному або мутантного аллели, що дозволяє визначити присутність мутації вже на стадії ПЛР по наявності або відсутності продукту ампліфікації.

Інший універсальний метод, широко застосовуваний для діагностики мутацій, – секвенування ДНК. Секвенування застосовується як для пошуку невідомих мутацій, так і для підтвердження порушень, виявлених іншими методами. Існуючі методи дозволяють секвенувати безпосередньо продукти ПЛР, минаючи стадію клонування ПЛР-фрагмента в бактеріях. Перевагою секвенування є універсальність і висока інформативність. Головним обмеженням цього методу є висока вартість, що не дозволяє використовувати його в якості основного при пошуку мутацій.

Кількість існуючих методів аналізу мутацій надзвичайно велике, а їх опис без перебільшення потребують окремої книги. Нижче наведені описи лише тих методів, які краще пристосовані до використання в клінічній практиці, тобто відповідають наступним вимогам: достатня чутливість виявлення мутацій, хороша відтворюваність, невисока вартість і можливість автоматизації.

Посилання на основну публікацію