Центрифугування

Основи методу центрифугування

Частинки в розчині осідають (седиментація), коли їх щільність вище щільності розчину, або спливають (флотація), коли їх щільність нижче щільності розчину. Чим більше різниця в щільності, тим швидше йде розподіл часток. Коли щільності частинок і розчину однакові (изопикнических умови), частки залишаються нерухомими. При малій різниці в щільності частинки можна розділити тільки в центрифузі, яка створює відцентрову силу, у багато разів перевищує силу земного тяжіння.

Ротори. Виникаюча в центрифузі відцентрова сила, яка, строго кажучи, створюється прискоренням, зазвичай виражається числом, кратним прискоренню вільного падіння g (g = 9,81 м / с2). Величини до 10000g отримують за допомогою простої настільної центрифуги, високошвидкісні рефрижераторні центрифуги дозволяють досягти 50000g, а ультрацентрифуги, що працюють з охолодженням і у вакуумі, – 500000g. Існують два типи роторів – кутові і вільно підвішені, так звані Бакет-ротори. Останні використовуються зазвичай у високошвидкісних центрифугах і Ультрацентрифуги.

Швидкість седиментації частки (ν) залежить від кутової швидкості (ω), ефективного радіуса ротора rефф (відстань від осі обертання) і седиментаційних властивостей частинок.

Седиментаційні властивості частинки характеризуються коефіцієнтом седиментації S і виражаються в одиницях Сведберга (1S = 10-13с). На схемі праворуч показано співвідношення між щільністю і коефіцієнтом седиментації для різних частинок в розчині хлориду цезію (CsCI). Величина S може коливатися в широких межах. Для порівняння коефіцієнтів седиментації в різних середовищах їх зазвичай коригують по щільності і в’язкості води при 20oC (S20w).

Коефіцієнт седиментації залежить від молекулярної маси (М) частинки, її форми (коефіцієнт тертя f), парціального питомої обсягу ΰ (величина, зворотна щільності частки). З малюнка видно, що білки, ДНК (DNA) і РНК (RNA) сильно розрізняються по щільності.

Б. Центрифугування в градієнті щільності

Макромолекули або органели, незначно розрізняються за розміром або по щільності, можна розділити центрифугуванням в градієнті щільності. Для цих цілей використовуються два методи.

При зональному центрифугировании анализируемая проба (наприклад, білки або клітини) нашаровується тонким шаром поверх буферного розчину. У процесі центрифугування частинки проходять через розчин, так як їх щільність вище щільності розчину. Швидкість руху залежить від маси і форми частинок (див. Формули на схемі А). Центрифугування припиняють перш, ніж частинки досягнуть дна центрифужной пробірки. Потім дно проколюють і збирають ряд фракцій, що містять різні частинки. Стабільність градієнта щільності в процесі центрифугування досягається застосуванням розчинів вуглеводів або колоїдного силикагеля, концентрація яких зростає від поверхні до дна пробірки. Градієнт щільності перешкоджає утворенню конвекційних потоків, що знижують якість розділення.
При изопикнических центрифугировании пробу (наприклад ДНК, РНК або віруси) рівномірно розподіляють у всьому об’ємі розчину (зазвичай CsCI). У цьому випадку поділ триває значно довше, ніж при зональному центрифугировании. Градієнт щільності створюється в процесі центрифугування за рахунок седиментації і дифузії. З часом кожна частка потрапляє в область, відповідну її власної плавучої щільності. Центрифугування припиняють, коли встановлюється рівновага. Отримані фракції аналізують, використовуючи відповідну вимірювальну техніку.

Посилання на основну публікацію