Якого кольору бактерії?

Зміст

  • Фарбування бактерій
  • Просте фарбування
  • Комбіновані (складні) методи фарбування
  • Забарвлення по Граму
  • Забарвлення за Цілем-Нельсену
  • Метод Пєшкова
  • Забарвлення по Леффлеру
  • Природне забарвлення колоній мікроорганізмів
  • Ліпохроми
  • Продігіозін
  • Бактеріофлуоресцін

Мікроорганізми у своєму нативному стані не видно не тільки в оптичні, але і в електронні мікроскопи. Причиною подібного явища є їх прозорість – тканини мікроорганізму мають коефіцієнт заломлення світла подібний склу.

Вивчення мікробів

Для вивчення прокариотов під мікроскопом використовуються різні методи фарбування, що дає можливість додати колір бактеріям або їх частинах. Крім того, мікроби володіють тинкторіальних властивостями – важливою особливістю, що складається в неоднакове взаємодії різних тканин прокаріоти з барвником.

Фарбування бактерій
Способів додати колір мікроорганізмам багато.

Залежно від предмета фарбування використовуються для цього методики поділяють на:

позитивні способи, що забарвлюють тканини мікроорганізмів;
негативні методи – окрашивающие простір навколо бактерії, в результаті чого вона стає видна як силует на пофарбованому тлі.
бактерііКак позитивне фарбування, так і негативне діляться залежно від стану мікроорганізму на:

вітальне (прижиттєве) фарбування – найчастіше застосовуються слабкі розчини метиленового синього, конго червоного і толуоідінового синього;
поствітальное (фіксоване) фарбування.
Фарбування фіксованих зразків найбільш ефективний спосіб додання бактерії кольору. Залежно від необхідного результату застосовують прості або складні методи фарбування.

Просте фарбування
Так, прості методи поствітального фарбування бактерії дозволяють отримати інформацію про те, якого розміру і форми мікроорганізм, встановити локалізацію і взаємне розташування окремих прокариотов.

Для додання кольору бактеріям зазвичай використовують розчини лужного метиленового синього або фуксину Пфейфера. Методологічно спосіб нескладний: розчин барвника наноситься на фіксований препарат і витримується, згідно з методикою, від 1 до 5 хвилин, після чого пофарбований зразок промивають (водою) і сушать. Препарат готовий, і можна проводити мікроскопічні дослідження.

Комбіновані (складні) методи фарбування
Чашка ПетріПрі глибших дослідженнях застосовуються складні способи фарбування фіксованих зразків. Складні методи додання кольору мікроорганізмам подразумевают вплив на досліджуваний препарат декількома фарбуючими реагентами, один з яких називають основним, а решта – додатковими. Також використовуються різні знебарвлюючі агенти:

кислоти (сірчана, соляна в різних розведеннях);
спирти (в основному етиловий);
ацетон та інші.
Складні методи забарвлення дозволяють виявити структуру мікроорганізму, інші властивості та особливості бактерії.

Найбільш поширеними методами надання кольору фіксованим препаратам є наступні:

метод Грама;
методика Ціля-Нельсона;
метод Пєшкова;
фарбування за Романовським-Гімзою.
Забарвлення по Граму
Методика фарбування бактерій, запропонована в 1884 році Г. Грам, набула широкого поширення і має велике значення для систематики мікроорганізмів і діагностики інфекційних хвороб.

Метод Грама заснований на біохімічні властивості клітинної стінки прокаріотів; він дозволяє розділити всі мікроорганізми на 2 групи:

грампозитивні – в результаті фарбування набувають стійкий синій колір;
грамнегативні – знебарвлюються при промиванні, після контрастного фарбування барвником червоного кольору набувають кольору від червоного до рожевого.
При фарбуванні за Грамом використовують анілінові барвники – метиловий фіолетовий і генціановий – з подальшою фіксацією барвника йодом. Пофарбований зразок промивають спиртом, після чого отримують 2 групи:

мікроорганізми, пофарбовані в синій колір, – грампозитивні;
знебарвлені бактерії – грамнегативні.
Колір бактерійОбесцвеченние грамнегативнімікроорганізми обробляють червоним барвником (сафранін або фуксин), забарвлює їх в колірному інтервалі червоний – рожевий.

Було встановлено, що забарвлення виявляє наявність у грамнегативнихмікроорганізмів зовнішньої мембрани, яка не дозволяє барвнику проникнути в клітину.

До грампозитивних бактерій відносяться майже всі коки і спороутворюючі бацили, а до грамнегативних – велика частина спороносних мікробів.

Забарвлення за Цілем-Нельсену
Дана методика поствітального фарбування, запропонована німецькими медиками Ф.Цілем і Ф.Нельсоном в1883 р, дозволяє визначити в пробі кислотостійкі бактерії, зокрема збудників лепри, туберкульозу та мікобактеріоза.окраска бактерій

Методика надання кольору мікробам заснована на присутності в клітинах кислотостійких прокариотов оксикислот, ліпідів і воску, що є причиною незадовільного фарбування розведеними барвниками.
При фарбуванні за Цілем-Нельсону фіксований препарат обробляють карболовим фуксином Циля і підігрівають над пальником до появи парів, охолоджують і повторюють процес 3 рази. По завершенні препарат промивають водою, знебарвлюють розчином сірчаної або соляної кислот і ретельно промивають. Далі препарат протягом 1 хвилини обробляють розчином метиленового синього, промивають водою і висушують.

У результаті колір кислотостійких мікроорганізмів – інтенсивно червоний, на тлі решти мікрофлори, що має світло-синє забарвлення.

При необхідності диференціювати бактерії лепри від збудника туберкульозу застосовується метод Семеновича-Марциновського:

бактерії лепри забарвлюються в блакитний колір;
збудники туберкульозу – безбарвні.
Метод Пєшкова
Забарвлення по Пешкову проводиться для виявлення ендоспор грампозитивних бактерій. Використовують рідина Карнуа, метиленовий синій, фуксин по Пфейфера (або нейтральний червоний).

Результат фарбування по Пешкову прекрасно микроскопируются:

зрілі ендоспори стають блакитними;
молоді ендоспори – насичено-сині;
цитоплазма набуває червоний колір;
хроматин – зерна набувають фіолетове забарвлення.
Забарвлення мікроорганізмів за Романовським-Гімзою

вирощування бактерійМетод забезпечує фарбування ацидофільних бактерій в різні відтінки червоного, а базофільних – в колірній гаммі від пурпура до синього. Методика має велике практичне значення при визначенні паразитів крові (спірохета) – цитоплазма мікроорганізмів забарвлюється в блакитний колір, а клітини, що містять ядра, – в червоно-фіолетовий.

Забарвлення по Леффлеру
Метод фарбування по Леффлеру дозволяє отримати зриму картину джгутиків бактерій шляхом послідовного застосування таніну і барвника. Також наявність джгутиків може виявити забарвлення по Морозову:

обробляють препарат кислотою, при цьому джгутики і оболонки розрихлюються;
протруюють таніном;
забарвлюють азотнокислим сріблом – джгутики і оболонка покриваються товстим шаром препарату і набувають колір в гамі від жовтого до насичено-коричневого.
Крім того, Леффлер розробив методику забарвлення дифтерійних бактерій метиленовим синім Леффлера (готують з спиртового розчину метиленового синього, слабкого розчину лугу і дистильованої води). У результаті обробки бактеріальна паличка набуває блакитного кольору, а гранули волютину дифтерійних бактерій забарвлюються в темно-синій.

Крім джгутиків, методики забарвлення бактерій дозволяють визначити наявність капсул, для чого застосовується методика Бурі-Гінса: послідовна обробка препарату розведеною тушшю, спиртом, фуксином Пфейфера. Після чого зразок промивається водою і висушується.

Вивчення мікроорганізмовКапсули виглядають як світлі ореоли, розташовані навколо червоних бактерій на темному фоні.

Природне забарвлення колоній мікроорганізмів
Існує ціла група мікроорганізмів, звана хромогенним бактеріями, колонії яких як у природі, так і на штучних середовищах пофарбовані яскраво і різноманітно. Колірна гамма представлена ​​від ніжно-лимонного до густого темно-синього і навіть чорного. Хромогенних бактерій безліч – це і коки, і палички, і спірили. Хімічний склад барвників теж дуже різноманітний.

Незалежно від кольору колонії все хромогенні бактерії абсолютно безбарвні, забарвлення забезпечують крапельки, кристалики або зернятка, розташовані поза клітин і є відходами життєдіяльності бактерій. Ці відходи можуть розчинятися і дифундувати в навколишнє середовище, що призводить до фарбування простору колонії.

Поняття «хромогенні бактерії» з’явилося в 1872 році завдяки Ф. Кону. Було виявлено, що бактерії, що володіють здатністю до хромогенезу, не є природною, а лише збірній групою, яку об’єднує лише здатність забарвлювати середовище.
Неодноразово були зроблені спроби класифікації хромогенних бактерій, проте успішних запропоновано не було.

бактерії в рідині під мікроскопомСегодня застосовується класифікація, заснована на розчинності пігменту:

пігмент водорастворім;
пігмент не розчиняється у воді, але розчиняється в спирті;
нерозчинний ні у воді, ні в спирті пігмент.
Дана класифікація недосконала, що пояснюється браком інформації як за природою пігменту, так і по самій функції хромогенеза.

Хромогенних бактерій відомо вже дуже багато, а сортів барвників, які вони виробляють, набагато менше. Це пояснюється тим, що різні хромогенні бактерії виробляють один і той же пігмент.

Всі бактеріальні пігменти ділять на 3 великі групи:

ліпохроми;
продігіозін;
бактеріофлуоресцін.
Ліпохроми
Поживна середу з додаванням агараКолоніі, що виділяють ліпохроми, пофарбовані у кольори від жовтого до червоного. До них відносяться майже всі коки і меншою мірою палички.

Фізико-хімічні властивості пігменту:

агрегатна форма – кристалики;
розчиняється у воді;
розчинний в органічних розчинниках (спирт, бензин, ефір, сірковуглець та ін.);
обмилюється гарячої лугом;
з концентрованою сірчаною кислотою дає синє забарвлення – ліпоціановая реакція ЦОПФ.
Продігіозін
Бактерії, що виділяють червоний пігмент продігіозін, відомі з давніх часів як бактерії «чудовою крові».

Про них згадував Піфагор, забороняючи своїм учням є варені боби, які простояли ніч – на них могла з’явитися «кров». У Середні століття помічали поява «чудовою крові» на продуктах, коли спочатку з’являються невеликі криваві крапельки, які дуже швидко ростуть і прямо заливають продукти кривавим шаром.

Поживні середовища в чашках ПетріПоявленіе «чудовою крові» зазначалося на багатих крохмалем продуктах – хлібі, рисі, поленті, вареному картоплі, буває на м’ясі або відварених яйцях, але досить рідко. Може розвинутися на молоці, тоді шар вершків забарвлюється в червоний колір, а саме молоко швидко створаживается.

Бактерії «чудовою крові» не є патогенними, проте деякі продукти їх життєдіяльності – токсальбуміном – володіють токсичними властивостями.

Фізико-хімічні властивості пігменту:

рідина;
малорастворим у воді;
розчиняється в органічних розчинниках (спирти, ефір, хлороформ, сірковуглець та інші);
при взаємодії з лугами утворюється оранжево-жовта фарба;
при впливі кислот утворюється кармінова і далі – фіолетова фарба;
сонячний колір руйнує пігмент у розчинах.
Бактеріофлуоресцін
Флуоресціюючий пігмент виробляють маленькі бактерії-палички, рухливі за рахунок джгутика на одному кінці, всі вони не утворюють спор.

Велика частина бактерій є сапрофіти і має широкий ареал проживання. Колонії виявляють зелено-трав’яну флуоресценцію.
Фізико-хімічні властивості пігменту:

в чистому вигляді не виділено, імовірно є білковим речовиною;
водорастворім;
не розчиняється у спиртах, ефірах і бензині;
концентрований розчин має блідо-жовтий колір і флуоресціює блакитним кольором;
обробка лугом зрушує флуоресценцію в зелений колір;
при додаванні кислоти флуоресценція припиняється.
Різноманітність мікрорганізмовКроме трьох основних пігментів, були виділені піоціанін (синій), піоксантін (червоно-бурий), сінціанеін (синій) та інші.

Одні бактерії утворюють пігмент завжди, інші мікроорганізми виділяють пігмент іноді. Є бактерії, які завжди виділяють тільки один пігмент, а є бактерії, що виділяють кілька різних пігментів.

Хромобактеріі вивчені недостатньо добре, не виявлені причини, від яких залежить втрата хромобактеріямі здатності виділяти пігмент. Такі колонії називають лейкорасой. Однак при подальших посівах лейкораса може дати нормальне окрашивающее потомство.

Вивчення здатності бактерій до хромогенезу представляє велику не тільки наукове, але й практичне значення.

Посилання на основну публікацію