Введення гена в вектор

Вектор – молекула ДНК, здатна переносити в клітку чужорідну ДНК і забезпечувати там її розмноження або – рідше включення в геном. Назва “вектор для клонування” введено М. Томасом в 1974р. Ген разом з вектором утворює рекомбинантную ДНК (р-ДНК).

Вектор-найважливіший компонент процесу клонування. Він повинен забезпечувати відносну легкість накопичення та виділення його в достатній кількості. Вектори повинні розмножуватися в клітині-хазяїні, і при введенні чужорідної ДНК їх функції не повинні істотно порушуватися. Для клонування ДНК можна використовувати різні вектори – плазміди, віруси, фаги, які в природних умовах служать інструментом для переносу чужорідної генетичної інформації.

Плазміди – малі молекули, що несуть по кілька генів, присутні в клітинах багатьох мікроорганізмів, рослин, тварин поряд з великою молекулою спадкової ДНК. Ці позахромосомних детермінанти спадковості є автономними структурами, що несуть свою інформацію у вигляді невеликої циклічної ДНК. До них відноситься, наприклад, статевої фактор – F-фактор, а також чинники лікарської резистентності (фактор R), які вивчаються з 1955 р, коли в Японії від хворого на дизентерію була виділена дизентерійна паличка, стійка до ряду антибіотиків і сульфамідів.

Вбудовування чужорідного фрагмента ДНК в геном вектора здійснюється в два етапи: спочатку ДНК вектора розрізається за допомогою рестриктаз, а потім у них вбудовується чужорідний фрагмент.

Розрізняють два типи фрагментів ДНК. Деякі з них мають на кінцях структури, здатні з’єднуватися один з одним – короткі гомологічні послідовності нуклеотидів (липкі кінці), інші не мають таких структур (фрагменти з тупими кінцями).

З’єднання фрагментів з тупими кінцями здійснюється під дією лігаз – ферментів, вперше описаних в 1967р. До такого кінця пришивають лігази однонитчатим липку ланцюг нуклеотидів, а до іншого фрагмента – комплементарную їй. При змішуванні їх розчинів липкі кінці знаходять один одного і з’єднуються водневими зв’язками, а потім їх зшиває лігаза. Незабаром було виявлено, що фаг Т4 утворює лігази, що сполучає тупі кінці. При комбінації різних рестриктаз і лігаз можна практично в будь-якому місці розрізати ДНК і зшити її. Тому відкриття цих ферментів привело до незвичайної розширенню експериментальних можливостей біології, дозволило проникнути в глиб явищ.

Для зшивання фрагментів ДНК використовують лінкери і адаптори. Лінкер (від англ. Link – з’єднувати} – це синтетичний, короткий дволанцюжкові олигонуклеотид, що містить сайти впізнавання для ряду рестриктаз; він може бути приєднаний до кінців фрагмента ДНК, отриманого за допомогою якої-небудь рестріктази, в процесі реконструювання рДНК. Адаптор-це линкер , що містить більше, ніж один сайт впізнавання рестриктазой, і забезпечує отримання фрагментів від дії однієї рестрикційної ендонуклеази для включення в сайт іншої рестріктази, тобто адаптор призначений для об’єднання фрагментів з несумісними кінцями.

При конструюванні векторів у них вводять гени-маркери, що кодують легко розпізнавані ознаки для виявлення та відбору подальших трансформантов, і кілька сайтів впізнавання різними рестриктазами в цілях отримання для клонування серії різних молекул ДНК.

Посилання на основну публікацію