Виділення кДНК інтерферонів

Для виділення генів або кДНК білків людини використовують різні підходи. У ряді випадків виділяють потрібний білок і визначають амінікіслотную послідовність соответствуйшего ділянки молекули. Виходячи з цього знаходять кодує його нуклеотидну послідовність, синтезують відповідний олигонуклеотид і використовують його в якості гибридизационного зонда для виділення потрібного гена або кДНК з геномних або кДНК-бібліотек. Інший підхід полягає у виробленні антитіл до очищеного білку і використанні їх для скринінгу бібліотек, в яких відбувається експресія певних генів. Для білків людини, синтезованих переважно в якійсь одній тканини, кДНК-бібліотека, отримана на основі мРНК, виділеної з цієї тканини, буде збагачена послідовністю ДНК-мішені. Наприклад, основним білком, синтезованим клітинами острівців Лангерганса підшлункової залози, є інсулін, і 70% мРНК, виділених з цих клітин, кодують саме його. Однак принцип збагачення кДНК непридатний для тих білків людини, кількість яких дуже мало або місце синтезу яких невідоме. У цьому випадку можуть знадобитися інші експериментальні підходи. Інтерферони (ІФ) людини, які включають a-, b – і g – інтерферони (ІФa, ІФb, ІФg), – це природні білки, кожен з яких може знайти своє терапевтичне застосування. При виділенні їх кДНК довелося розробити новий підхід, що дозволяє подолати труднощі, пов’язані з недостатнім вмістом відповідних мРНК і білків. Процедура виділення кДНК інтерферонів полягала в следуюшем.

1. З лейкоцитів людини виділили мРНК і фракціонували її за розмірами; провели зворотну транскрипцію і вбудували в сайт PstI плазміди pBR322.

2. Отриманим продуктом трансформували Escherichia соli. Утворилися 6000 клонів розділили на 12 груп: по 512 клонів у кожній. Тестування проводили на групі клонів, що дозволило прискорити процес їх ідентифікації.

3. Кожну групу клонів гібридизували з неочищеним препаратом ІФ-мРНК.

4. З утворилися гібридів, що містять клоновану ДНК і мРНК, виділили мРНК і провели її трансляцію в бесклеточной системі синтезу білка.

5. Визначили інтерферону противірусну активність кожної суміші, отриманої в результаті трансляції. Групи, що проявили інтерферону активність, містили клон з кДНК, гібрідізовшейся з ІФ-мРНК.

6. Позитивні групи розбили на 8 підгруп, що містять по 64 клона, і знову провели тестування. Розбиття на підгрупи повторювали доти, поки не ідентифікували клон, що містить повнорозмірну ІФ-кДНК людини.

Якщо потрібно отримати великі кількості ІФ, відповідну кДНК можна субклоніровать в експрессируются Е. соli-векторі, який дозволяє досягти високого рівня експресії.

Посилання на основну публікацію