Синтез L-аскорбінової кислоти

В даний час для великомасштабного виробництва L-аскорбінової кислоти (вітаміну С) використовують досить трудомісткий процес, що включає одну мікробіологічну стадію і кілька хімічних; вихідним субстратом для нього є D-глюкоза. На останньому етапі цього процесу 2-кето-L-гулонової кислота (2-KLG) перетворюється на кислих умовах в L-аскорбінову кислоту. Біохімічні дослідження метаболізму різних мікроорганізмів показали, що 2-KLG можна отримати іншим шляхом. Так, одні бактерії (Acetobacter, Gluconobacter і Erwinia) можуть перетворювати глюкозу в 2,5-дікето-D-глюконову кислоту (2,5-DKG), а інші (Corynebacterium, Brevibacterium і Arthrobacter), які синтезують фермент 2,5-DKG -редуктазою, – перетворювати 2,5-DKG в 2-KLG.

Використовується в даний час спосіб отримання аскорбінової кислоти можна вдосконалити, якщо включити в нього спільне культивування зазначених мікроорганізмів для перетворення глюкози в 2-KLG. На жаль, таке культивування має свої труднощі. Наприклад, використовувані мікроорганізми можуть мати різні оптимум температури і рН, можуть розрізнятися також склад середовища і швидкість росту. Іншими словами, умови культивування, оптимальні для одного організму, можуть бути неприйнятні для іншого, що призведе до спонтанного «вимивання» з середовища одного з них. У подібних випадках можна культивувати мікроорганізми послідовно, правда такий процес важко буди зробити безперервним, якщо для росту мікроорганізмів необхідні істотно різні середовища. Найкращим виходом з цієї ситуації було б створення одного мікроорганізму, який синтезує всі ферменти, необхідні для перетворення глюкози в 2-KLG. Erwinia herbicola здійснює перетворення D-глюкози в 2,5-DKG і кілька стадій, каталізуються різними ферментами, в той час як Corynebacterium sp. для перетворення 2,5-DKG в 2-KLG необхідна тільки одна стадія. Отже, найбільш простий спосіб створення одного мікроорганізму, здатного перетворювати D-глюкозу в 2-KLG, полягає у виділенні гена 2,5-DКG-редуктази Corynebacterium sp. та введення його в Erwinia herbicola.

Перший крок на цьому шляху полягає у виділенні і очищенні 2,5-DKG-редуктази Corynebacterium sp. і визначенні послідовності її перших 40 N-кінцевих амінокислот. Виходячи з цих даних були синтезовані два 43-нуклеотидних гібрідізаціонних зонда, які відповідали різним частинам білкової молекули. Оскільки 71% нуклеотидів ДНК Corynebacterium sp. являють собою або G, або С, зонди синтезували таким чином, щоб у третьому положенні кодонів по можливості знаходилися саме вони. Це дозволяло мінімізувати число неспарених підстав між зондами і шуканої ДНК.

Синтезовані зонди використовували для скринінгу банку клонів ДНК Corynebacterium; клони, гібридизується тільки з одним з зондів, виключали з подальшого розгляду, вважаючи, що відповідна ДНК не є шуканої. Виділяли клон, що містить ген 2,5-DKG-редуктази, і секвенували його. Нуклеотидні послідовності, расположенньі до стартового кодону ATG, вирізали і замінювали їх сигналами транскрипції і трансляції, функціонуючими в Е. coli, оскільки регуляторні послідовності грампозитивнихмікроорганізмів типу Corynebacterium spр. не функціонують в клітинах цього мікроорганізму. Отриману конструкцію вводили в Е. coll (при цьому синтезувалася активна 2,5-DKG-редуктаза), а потім переклоніровалі у векторі з широким колом господарів і трансформували їм Erwinia herbicola.

Трансформовані клітини Erwinia активно перетворювали D-глюкозу безпосередньо в 2-KLG, при цьому власні ферменти Erwinia, локалізовані у внутрішній мембрані бактеріальної клітини, перетворювали глюкозу в 2,5-DKG, а 2,5-DKG – редуктаза, локалізована в цитоплазмі, каталізувала перетворення 2,5-DKG в 2-KLG. Таким чином, за допомогою генетичних маніпуляцій метаболічні реакції, які у настільки різних мікроорганізмах, вдалося здійснити в одному з них. Цей гібрид придбав здатність синтезувати кінцевий продукт комбінованого метаболічного шляху. Такий організм потрібно використовувати як фабрику для виробництва 2-KLG, яка замінює перші три стадії в тому процесі отримання L-аскорбінової кислоти, який використовується в даний час.

Комерційну цінність 2,5-DKG-редуктази можна підвищити, якщо зробити амінокислотні заміни, що підвищують каталітичну активність ферменту і його термостабільність. У той час, коли був ідентифікований ген 2,5-DKG-редуктази, амінокислотні залишки, що у освіті активного центру цього ферменту, ще не були встановлені. Однак, виходячи з даних про амінокислотноїпослідовності ферменту, була відтворена його вторинна структура, що складається з восьми тісно розташованих паралельних, b-шарів, що перемежовуються вісьмома a-спіралями, які з’єднувалися з b-шарами петлями різної довжини. Такий характер укладання поліпептидного ланцюга був встановлений для 17 інших ферментів з уже відомою кристалічною структурою, і за аналогією з ними були ідентифіковані три петлі, можливо беруть участь у зв’язуванні субстрату. З помошью олигонуклеотид-спрямованого мутагенезу були отримані 12 мутантних білків, кожен з яких містив одну амінокислотну заміну в одній з петель. 11 мутантних форм 2,5-DKG-редуктази володіли більш низькою питомою активністю, ніж нативний фермент, а 12-а, у якої залишок глутаміну в положенні 192 був замінений на аргінін, була приблизно в два рази більш активною. За даними кінетичних досліджень, підвищення активності було пов’язано зі збільшенням у 1,8 разів максимальної швидкості (Vmax) і зменшенням на 25% константи Міхаеліса (Км) реакції, що каталізується ферментом. Заміна гліціновая залишків в положеннях 55 і 57 на аланіновой дозволила отримати більш термостабільний фермент в порівнянні з нативной формою. Подальші зусилля будуть імовірно, спрямовані на отримання ферменту поєднує обидва ці властивості.

Посилання на основну публікацію