Противірусні вакцини

В якості ефективної живою противооспенной вакцини широко використовують вірус коров’ячої віспи (ВКО), що відноситься до роду поксвирусов. Геном цього вірусу повністю секвенирован; він являє собою двухцепочечную ДНК довжиною 187т. п.н., що кодує приблизно 200 різних білків. ДНК ВКО реплицируется в цитоплазмі інфікованих клітин, а не в ядрі, завдяки наявності у вірусу генів ДНК-полімерази, РНК-полімерази і ферментів, що здійснюють кепірованіе, метилювання і поліаденілювання мРНК. Тому, якщо в геном ВКО вбудувати чужорідний ген, так щоб він знаходився під контролем ВКО-промотора, то він буде експресуватися незалежно від регуляторних та ферментних систем господаря.

ВКО має широкий спектр господарів (хребетних і безхребетних), залишається життєздатним протягом багатьох років після ліофілізації (випаровування води за допомогою заморожування) і не володіє онкогенними властивостями, а тому може використовуватися для створення так званих векторних вакцин. З їх допомогою здійснюється доставка і експресія в організмі-хазяїні клонованих генів, що кодують антигенні білки, які індукують вироблення протективних антитіл. Геном ВКО має великі розміри і не містить унікальних сайтів рестрикції, що не дозволяє вбудовувати в нього додаткові нуклеотидні послідовності. Однак потрібні гени можна вводити в геном ВКО за допомогою гомологичной рекомбінації in vivo таким чином.

1. Сегмент ДНК, що кодує специфічний антиген (наприклад, HBcAg), вбудовують в плазмідний вектор безпосередньо після клонованого ВКО-промотора, включеного в якій-небудь несуттєвий ген ВКО, наприклад ген тимідинкінази.

2. Цією плазмидой трансформують культуру дефектних за тимідинкіназою тварин клітин, зазвичай фібробластів курячого ембріона, попередньо інфікованих ВКО дикого типу, який синтезує функціональну тимідинкіназу.

3.В результаті рекомбінації між нуклеотидними послідовностями, фланкуючими промотор і ген протективного антигену, і гомологічними послідовностями вірусного генома відбувається вбудовування клонованого гена у вірусну ДНК. Частота таких рекомбінацій невисока, проте популяцію клітин, що містять рекомбінантний ВКО, можна збагатити, використовуючи селективну середу з бромдезоксіурідіна. Цей токсичний аналог тимідину в відсутність тимідинкінази не включається до синтезируемую ДНК і не має токсичної дії. Дефектні по тимідинкіназою клітини-господарі, які містять звичайний ВКО, у присутності бромдезоксіурідіна гинуть, а клітини, що несуть рекомбінантний ВКО з розривом в гені тимідинкінази, стають стійкими до його токсичній дії.

4. Проводять остаточний відбір за допомогою ДНК-зонда, гібридизується з геном антигенного білка.

Оскільки дефектні по тимідинкіназою ВКО спонтанно виникають з відносно високою частотою (приблизно 1 на 103-104 вірусних частинок), нерідко проводять котрансфекцію клітин яким-небудь селективним маркером і потрібним геном. Це полегшує розмежування спонтанних мутантів і мутантів, отриманих за допомогою гомологичной рекомбінації. В якості селективного маркера зазвичай використовують ген ПЕО, що кодує фермент неоміцин-фосфотрансферази II і забезпечує стійкість до аналогу канаміцину G-418. Цей ген, на відміну від інших селективних маркерів, залишається стабільним при вбудовуванні в геном ВКО.

Розроблена спеціальна система, що дозволяє уникнути переривання рамки зчитування генів ВКО при вбудовуванні чужорідного гена. При цьому відпадає необхідність у використанні селективних маркерів, оскільки кожен утворює бляшку рекомбінантний вірус буде містити і експресувати ген-мішень. ДНК ВКО дикого типу несе ген vp37, відповідальний за утворення бляшок при зростанні вірусу в монослойной культурі клітин тварин. Якщо замінити цей ген маркерним геном Е. coli, то утворюється мутантний ВКО, який не формує бляшки при вирощуванні його протягом 2-3 діб в культурі клітин тварин. Ген-мішень вводять в цей мутантний вірус за допомогою гомологичной рекомбінації його ДНК з вектором, що несе ген vp37 і ген-мішень. Мутантний ВКО, що отримав ген vp37, набуває здатності до утворення бляшок, при цьому в його геном вбудовується ген-мішень, а маркерний ген втрачається. Мутантний вірус з делегованим геном vp37не може ревертіровать до дикого типу, тому кожна вірусна частка, що утворює бляшку, містить бажану конструкцію. Цей метод простий, застосуємо для перенесення та експресії будь-якого гена-мішені, не вимагає яких-небудь додаткових маркерних генів і не перериває рамку зчитування генів ВКО.

У геном ВКО вже вдалося вбудувати і експресувати в культурі клітин тварин кілька генів антигенних білків: G-білка вірусу сказу, поверхневого антигену гепатиту В, поверхневих білків вірусу Сіндбіс, NP – і НА-білків вірусу грипу, N – і G-білків вірусу везикулярного стоматиту, глікопротеїнів вірусу простого герпесу. Деякі з отриманих на основі ВКО рекомбінантних векторів можна використовувати для створення ефективних вакцин. Так, рекомбінантний ВКО, експресуючий ген глікопротеїну D вірусу простого герпесу типу 1, запобігає герпесні інфекції у мишей, а рекомбінантний ВКО, експресуючий ген поверхневого антигену вірусу сказу, індукує вироблення протективних антитіл у лисиць, основних переносників вірусу сказу в Європі.

Векторні ВКО-вакцини дозволяють провести імунізацію відразу від декількох захворювань. Для цього можна використовувати рекомбінантний ВКО, який несе кілька генів, що кодують різні антигени.

Залежно від використовуваного ВКО-промотора чужорідний білок може синтезуватися в ранній або пізній фазі інфекційного циклу, при цьому його кількість визначається силою промотора. Зазвичай для досягнення високого рівня експресії використовують «пізні» ВКО-промотори: pll (промотор гена, відповідального за синтез білка мовляв. Масою 11 кДа) або рСАЕ (промотор гена інтегрального білка вірусу коров’ячої віспи типу А). При вбудовуванні в одну ДНК ВКО декількох чужорідних генів кожен з них поміщають під контроль окремого ВКО-промотора, щоб запобігти гомологичную рекомбінацію між різними ділянками вірусної ДНК, яка може призвести до втрати вбудованих генів.

Жива рекомбінантна вірусна вакцина має ряд переваг перед неживими вірусними і суб’едінічнимі вакцинами: 1) презентація автентичного антигену практично не відрізняється від такої при звичайній інфекції; 2) вірус може реплицироваться в клітці-господаря і збільшувати кількість антигену, який активує продукцію антитіл В-клітинами (гуморальний імунітет) і стимулює вироблення Т-клітин (клітинний імунітет); 3) вбудовування генів антигенних білків в один і більше число сайтів генома ВКО ще більше зменшує його вірулентність.

Недолік живий рекомбінантної вірусної вакцини полягає в тому, що при вакцинації осіб зі зниженим імунним статусом (наприклад, хворих на СНІД) у них може розвинутися важка вірусна інфекція. Щоб вирішити цю проблему, можна вбудувати в вірусний вектор ген, що кодує людський інтерлейкін-2, який стимулює Т-клітинну відповідь і обмежує проліферацію вірусу.

Небажані побічні ефекти проліферації ВКО можна попередити інактивацією вірусу після вакцинації. Для цього був створений чутливий до інтерферону вірус (ВКО дикого типу відносно стійкий до його дії), проліферацію якого можна регулювати в разі виникли при вакцинації ускладнень.

Механізм стійкості ВКО до інтерферону залишався невстановленим, поки не була виявлена ??відкрита рамка зчитування K3L, що кодує білок мовляв. масою 10,5 кДа. Цей білок містить амінокислотну послідовність, гомологичную N-кінцевій частині еукаріотичного фактора ініціації elF-2a мовляв. масою 36,1 кДа. N-кінцеві області обох білків містять 87 практично ідентичних амінокислотних залишків, причому в положенні 51 в обох випадках знаходиться серії, який в elF-2a фосфорилируется активируемой інтерфероном Р1-кінази, що призводить до інгібування синтезу білка в оброблених інтерфероном клітинах. КЗЬ-білок діє як конкурентний інгібітор фосфорилирования elF-2альфа, забезпечуючи стійкість ВКО до інтерферону, і якщо з генома ВКО видалити ген K3L або його частина, то вірус стане чутливим до інтерферону. За допомогою ПЛР-мутагенезу гена K3L, що знаходиться у складі плазміди, і подальшої гомологичной рекомбінації між ДНК ВКО і плазмидой з метою заміни К3L-послідовності дикого типу модифікованим варіантом був сконструйований мутантний ВКО K3L -. Цей штам виявився в 10-15 разів більш чутливим до інтерферону, ніж штам дикого типу. Ця робота є важливим етапом на шляху створення більш безпечних ВКО-векторів. Послідовності, схожі з K3L, можуть містити й інші стійкі до інтерферону віруси, що дозволить за допомогою делеций створювати їх штами, чутливі до інтерферону.

Більшість робіт зі створення живих вірусних вакцин проводилися на ВКО, проте в якості кандидатів на роль векторів для вакцинації розглядаються і інші віруси: аденовірус, поліовірус і вірус вітряної віспи. Вектор на основі живого аттенуированного поліовірусу (його дослідження тільки починаються) привабливий тим, що дозволяє проводити пероральну вакцинацію. Такі «слизові» вакцини (вакцини, компоненти яких зв’язуються з рецепторами, розташованими в легенях або шлунково-кишковому тракті) придатні для профілактики найрізноманітніших захворювань: холери, черевного тифу, грипу, пневмонії, мононуклеозу, сказу, СНІДу, хвороби Лайма. Але до будь-яких клінічних випробувань будь-якого на перший погляд нешкідливого вірусу як системи доставки та експресії відповідного гена необхідно переконатися в тому, що він дійсно безпечний. Наприклад, повсюдно використовується ВКО викликає у людей ускладнення з частотою приблизно 3,0-10-6. Тому з генома рекомбінантного вірусу, який передбачається використовувати для вакцинації людини, бажано видалити послідовності, відповідальні за вірулентність.

Посилання на основну публікацію