Плазміди

Для того щоб молекула чужорідної ДНК не губилася при діленні клітин, вона або повинна бути вбудована в ДНК клітини, або повинна містити спеціальні послідовності, які забезпечують її правильне подвоєння і розбіжність в обидві дочірні клітини при розподілі. Такі послідовності називають “векторами”. Найбільш поширеними векторами є плазміди.

Плазміди є кільцеві двуцепочечние молекули ДНК, що складаються з декількох тисяч пар нуклеотидів. Кожна бактерія, крім основної молекули ДНК кільцевої форми розміром близько 5×106 пар нуклеотидів, може містити кілька різних плазмід. Вони містять регуляторні ділянки, які дозволяють їм подвоюватися незалежно від реплікації бактеріальної ДНК.
Плазміди несуть такі життєво важливі для бактерії гени, як гени стійкості до різних факторів: наприклад, лікарських препаратів (антибіотики) або важкими металами. Бактерія, що має різні плазміди, набуває стійкість до різних факторів. Бактерії можуть досить легко обмінюватися плазмидами один з одним.

Стійкість до антибіотиків, яку плазмида надає бактеріальної клітці, значно спрощує відбір тих бактерій, в які проникла плазмида. Так, у нас є плазміда, що несе стійкість до ампіциліну. З’єднуємо її з геном потрібного нам білка і вносимо в суспензію бактерій. Бактерії висіває на поживне середовище, що містить ампіцилін. Ті бактеріальні клітини, які не містять плазміду, гинуть. Залишаються тільки ті, які отримали плазмиду-вектор. Вони розмножуються на живильному середовищі, і разом з ними відбувається розмноження плазміди з вбудованою ДНК. Кажуть, що йде клонування рекомбінантної ДНК.

Послідовність, що кодує ДНК або створюють штучним чином, грунтуючись на послідовності амінокислот в поліпептиди, або синтезують за допомогою зворотної транскриптази на молекулі іРНК, або виділяють відповідний ген з клітинної ДНК.

Найчастіше процес пошуку гена починається з конструювання “бібліотеки ДНК”. Для отримання бібліотеки сумарну ДНК клітини фрагментують і клонують в плазмидах або фагах. Якщо при цьому ми отримали досить багато клонів, що містять різні фрагменти ДНК, то ми можемо сподіватися, що для будь-якого гена клітини знайдеться клон його містить. Така бібліотека називається представницької. Представницька бібліотека ДНК людини повинна містити не менше 1500000 незалежних клонів. Серед отриманих клонів за допомогою гібридизації відшукують той, який містить ДНК, що кодує потрібний нам білок.

Для проведення реакції гібридизації необхідно мати одноцепочечную молекулу ДНК, комплементарних частини структурного гена і містить радіоактивні ізотопи. Крім того, потрібно мати відбитки колоній бактерій, отримані методом реплік. Ці відбитки наносяться на спеціальний папір, яка утримує бактерій. Потім її обробляють таким чином, щоб викликати загибель бактерій і денатурацію їх ДНК, і наносять на неї розчин комплементарної ДНК з радіоактивною міткою. У тих місцях, де відбувається гібридизація, на спеціальному приладі виявляється підвищений радіоактивне випромінювання. Саме ці клони бактерій залишають для подальшого розмноження і отримання потрібної кількості гібридної ДНК.
Простота пристрою плазмід і легкість, з якою вони “входять і виходять” з бактерій, використовується генними інженерами для введення в клітини бактерій генів вищих організмів. Крім плазмід, як векторів використовують ДНК фагів, вірусів та ін.
Вибір вектора залежить від цілей, які переслідує впровадження чужорідної ДНК.

Для впровадження чужорідної ДНК в клітини еукаріот потрібні складніші методи. Наприклад, використовують хімічні речовини, що порушують цілісність плазматичноїмембрани, або “обстрілюють” клітини найдрібнішими металевими кульками, покритими молекулами ДНК, і т.д.
Перенесення генів в бактеріальні клітини дав унікальну можливість отримання рідкісних білків людини в промислових масштабах. Так, з початку 80-х рр. з бактерії Escherichia coli отримують такі білки, як соматотропін (гормон росту), інтерферон та інсулін, який необхідний для лікування деяких форм цукрового діабету.

На цукровий діабет страждають кілька мільйонів людей на Землі. Інсулін для їх лікування раніше отримували з органів тварин. Однак у багатьох пацієнтів такий інсулін викликав різку імунологічну реакцію і приводив до обтяження стану здоров’я. В даний час інсулін виробляється генно-інженерними методами.

Ген інсуліну людини містить інформацію про послідовність 108 амінокислот. Виділяється в кров зрілий інсулін складається з двох поліпептидних ланцюгів, 21 і 30 амінокислот, з’єднаних дисульфідними зв’язками. Дозрівання білка відбувається поступово. Спочатку відрізаються 24 амінокислотних залишку на N-кінці молекули. Вони служать сигналом для синтезу поліпептиду на мембрані ЕРС. У цистернах апарату Гольджі відбувається вирізання послідовності з 33 амінокислотних залишків (С), вона необхідна для правильного утворення дисульфідних містків. Зрозуміло, що процеси дозрівання білка в прокариотической клітці відбуватися не можуть. Тому, для бактеріального виробництва інсуліну були спочатку синтезовані хімічним способом дві послідовності А і В. Потім їх вбудували в структурний ген плазміди, впровадили в клітини E. coli. Білки були синтезовані. З них вирізали послідовності А і В, потім хімічно ініціювали утворення між ними дисульфідних зв’язків. Такий сконструйований інсулін нічим не відрізнявся від інсуліну, синтезованого клітинами людини.

З’ясування точної послідовності нуклеотидів в гені є одним з найважливіших етапів його вивчення. Процес визначення первинної структури гена називається секвенуванням.

Принцип одного з методів секвенування пояснимо на такому прикладі. Припустимо, що у нас є нуклеотидная послідовність з 10 нуклеотидів. Ми приєднуємо радіоактивну мітку до нуклеотиду, що знаходиться на 5-кінці. Потім ділимо розчин ДНК на чотири пробірки. У кожній пробірці проводимо специфічну реакцію, яка розриває ДНК після певного нуклеотиду. Далі проводимо електрофоретичної поділ фрагментів з кожної пробірки і зіставляємо розміри фрагментів, що містять радіоактивну мітку. За допомогою такого методу можна “прочитати” в одному експерименті послідовність з декількох сотень нуклеотидів.
На початок 2000 року встановлено нуклеотидні послідовності ДНК багатьох вірусів і бактерій, пекарських дріжджів, одного з виду круглих черв’яків. До кінця 2001 року практично “прочитана” вся ДНК людини. її аналіз
дозволить зрозуміти молекулярні основи виникнення хвороб людини і цілеспрямовано шукати способи їх лікування.

Посилання на основну публікацію