Нерадіоактивні методи детекції

У більшості лабораторій для гібридизації використовують зонди, мічені яким-небудь радіоактивним ізотопом, найчастіше 32Р. Такі зонди володіють високою питомою радіоактивністю і забезпечують хороше ставлення сигнал / шум. Радіоактивно мічений зонд наносять на фільтр з фіксованою на ньому ДНК-мішенню, проводять гібридизацію, відмивають незв’язані ДНК-зонд і детектируют мітку за допомогою радиоавтографии.

Однак 32Р є короткоживущим ізотопом, що випускає високоенергетичне випромінювання; при роботі з ним необхідно використовувати спеціальне обладнання і забезпечувати безпечну утилізацію відходів. Щоб обійти ці труднощі, були створені нерадіоактивні системи детекції. Для посилення гибридизационного сигналу в цьому випадку використовується ферментативне перетворення хромогенного або хемілюмінесцентного субстрату: перший з них під дією ферменту змінює забарвлення, а другий випромінює світло. У більшості подібних систем застосовуються ДНК-зонди, що містять біотінілірованние нуклеотиди. Гібридизація і детекція сигналу проводяться більш-менш стандартним чином.

1. Зонд, мічений біотином, гибрідизуючою з ДНК-мішенню.

2. Промивають фільтр для видалення надлишку незв’язаних зонда.

3.Добавляют авидин (білок курячого яйця) або стрептавидин (бактеріальний аналог авідіна).

4. Додають біотінілірованние фермент – лужну фосфатазу або пероксидазу хрону.

5. Залежно від використовуваного ферменту додають хромогенний або хемілюмінесцентний субстрат і реєструють зміна забарвлення або люмінесценцію, супроводжуючу перетворення субстрату в продукт.

В якості альтернативи після гібридизації ДНК з біотінілірованние зондом можна додавати вже готовий комплекс стрептавидин-фермент, який має сайт зв’язування з біотином.

Як авидин, так і стрептавидин зв’язуються з біотином дуже міцно (константа дисоціації (Kd = 10-15); крім того, кожен з білків має чотири незалежних біогінсвязивающіх сайту, завдяки чому одна молекула авідіна або стрептавідину може одночасно приєднувати фермент і зонд, мічені біотином . Біотінілірованіе і зв’язування зі стрептавідином не призводять до зниження ферментативної активності. В хромогенних системах детекції в тому місці, де знаходиться гібридна ДНК, під дією ферменту утворюється нерозчинний барвник, а в хемілюмінесцентних системах – продукт, який випромінює світло.

Нерадіоактивні системи детекції володіють і іншими перевагами: біотінілірованние ДНК залишається стабільною при кімнатній температурі як мінімум рік; методи реєстрації хемілюмінесценції володіють такою ж чутливістю, як і методи реєстрації радіоактивного сигналу; детекція випускається світла за допомогою рентгенівської плівки або люмінометра, як і реєстрація зміни кольору, займають кілька годин Мабуть, хемілюмінесцентні системи реєстрації сигналу, все ж більш чутливі, ніж хромогенні, незабаром витіснять вага інші, що використовуються при ДНК-діагностики. Якщо при цьому застосовується ПЛР, то ампліфіціруемого продукт можна помітити флуоресцентним барвником, приєднуючи його до 5′-кінця кожного праймера. Як барвників часто використовують флуоресцеїн і родамін, які випускають зелений і червоний світло відповідно. Після ПЛР-ампліфікації ДНК-мішені проводять поділ флуоресцеин-міченого праймера і продуктів ампліфікації, після чого реєструють включення мітки. Якщо ДНК-мішень у зразку відсутній, то не буде утворюватися і флуоресціюючий продукт.

Один з нещодавно розроблених нерадіоактивних методів детекції заснований на використанні зонда – «молекулярного маяка». Такий зонд складається з 25 нуклеотидів. Середні 15 з них комплементарні ДНК-мішені і не спаровуються один з одним, а 5 кінцевих нуклеотидів взаємно комплементарні і утворюють шпильку. До 5′-кінця приєднаний флуоресцентний хромофор (флуорофор), а до -кінцю – нефлуоресцентний хромофор (гасників), на який передається енергія збудження флуорофора. У розчині при кімнатній температурі «маяк» має таку конфігурацію, при якій флуорофор і гасників знаходяться в тісному контакті, і флуоресценція флуорофора гаситься. Коли ж 15 середніх нуклеотидів зонда гибрідизуючою з комплементарною послідовністю ДНК – або РНК-мішені, відбувається просторове розділення флуорофора і гасників, і зонд випромінює світло. Температура, реакційній суміші повинна бути близька до кімнатної, оскільки при її підвищенні шпилька денатурує, флуорофор і гасників розходяться і відбувається флуоресценція. Необхідно також, щоб всі 15 нуклеотидів зонда були комплементарні відповідній послідовності ДНК – або РНК-мішені.

Посилання на основну публікацію