Мікротехніка

Розміри клітин мають величини, виражені в мікрометрів (мкм). Середній розмір тваринної клітини 20-40 мкм, рослинні клітини зазвичай в 2 рази більшими. Мікрометр – це тисячна частка міліметра, т. Е. 1 мм = 1000 мкм. Більшість клітинних структур складають десяті частки мікрометра. Такі структури можна побачити тільки за допомогою мікроскопів.
Перші найпростіші мікроскопи були винайдені в кінці XVI ст. і представляли систему лінз над предметним столиком. За допомогою такого мікроскопа не можна було побачити клітини, він не давав достатнього збільшення. У XVII ст. мікроскоп був вдосконалений, і з його допомогою Р. Гук та А. ван Левенгук здійснювали свої спостереження і відкриття по клітинному будові кори дерева, крові, чоловічого еякулята, наявності одноклітинних істот у водному настої листя сени. У XVIII в. стали накопичуватися дані про клітинну будову рослин і деяких тварин. Клітини описувалися як прозорі осередки, які мають оболонку.
На початку XIX ст. з’являються зачатки мікроскопічної техніки – способи приготування тонких зрізів тканин тварин. Так, чеський дослідник Я. Пуркіньє і його учні розробили і використовували мікротом для приготування тонких зрізів спинного мозку, мозочка і інших тканин, а також забарвлення зрізів, в результаті чого було описано живе вміст клітини – протоплазма. Використання спеціальних барвників робить внутрішню структуру клітини більш контрастною, що дозволило в 30-ті роки XIX ст. сформувати уявлення про наявність ядра в рослинних і тваринних клітинах.
У другій половині XIX ст. світловий мікроскоп був ще раз вдосконалений, змінена його конструкція. Освітлення препарату стали виробляти знизу через систему лінз конденсора. За рахунок застосування об’єктивів і окулярів підвищилася роздільна здатність мікроскопів, з’явилася можливість розрізняти в клітці не тільки ядро ​​і протоплазму, але й інші дрібніші структури. Конструкція сучасних світлових мікроскопів, які студенти використовують на своїх заняттях, мало чим відрізняється від вдосконалених мікроскопів другої половини XIX ст.
Будь-який сучасний світловий мікроскоп має у своєму складі три оптичні системи, що працюють спільно: конденсор, об’єктив і окуляр. Конденсор являє собою систему лінз, які дозволяють сфокусувати джерело освітлення і освітити об’єкт знизу, щоб промені світла проходили через тонкий зріз. Конденсор має діафрагму, яка дозволяє регулювати інтенсивність освітлення, роблячи його яскравішим або слабкіше.
Промені світла, пройшовши через зріз, фокусуються об’єктивом. Саме об’єктив створює первинне збільшення об’єкта, дає його дозвіл, дозволяє побачити найдрібніші структури клітини. Окуляр збільшує зображення, побудоване об’єктивом, і направляє його в око дослідника. Дозвіл об’єкта залишається таким, яким його зробив об’єктив. Загальне збільшення об’єкта буде дорівнює добутку збільшення об’єктива на збільшення окуляра. На заняттях з цитології найчастіше використовується об’єктив зі збільшенням × 40 і окуляр, що дає збільшення в 15 разів, тоді загальне збільшення буде 40 × 15. Неважко підрахувати, що це збільшення в 600 разів. Прийнято записувати збільшення препарату як 40 × 15; такий запис показує дозвіл об’єкта, які деталі мають бути виявлені на препараті, об’єктив з яким збільшенням використовувався для його аналізу.
Світловий мікроскоп, як будь-який оптичний прилад, має важливу характеристику – роздільну здатність. Це мінімальна відстань між двома точками, які видно роздільно. Для сучасних світлових мікроскопів роздільна здатність дорівнює 0,2 мкм, що відповідає середнім розмірам мітохондрій. Тобто під світловим мікроскопом при максимальному його вирішенні мітохондрії будуть видні у вигляді точок з мінімальними розмірами. Приблизно також будуть виглядати і багато інших органели цитоплазми тваринної клітини. У рослинній клітині є більш великі структури – хлоропласти та інші пластиди, розміри яких кілька мікрометрів.
Причиною того, що дрібні структури клітини видно в світловий мікроскоп нечітко, є ефект оптичної дифракції. У мікроскопі яскрава точка буде збільшена і виглядає як яскрава пляма. Два прилеглих точкових об’єкта дають перекриваються зображення плям, які зливаються в одну пляму.
Живі клітини безбарвні і прозорі. Їх показник заломлення близький до показника заломлення навколишнього розчину. Тому незабарвлені клітини важко розглядати під мікроскопом. На початку XIX ст. вчені стали використовувати кольорові барвники, які робили клітинні структури більш контрастними і видимими в світловий мікроскоп. Зараз таких барвників безліч. Деякі з них переважно фарбують певні клітинні органели. Найбільш часто використовувані барвники для виявлення загальної морфології клітин – це гематоксилин і еозин. Гематоксилін має спорідненість до негативно зарядженим молекулам, тому виявляє розподілення у клітинах дезоксирибонуклеїнової кислоти і кислих білків. Обробка клітин гематоксилином призводить до виявлення структур ядра: хроматину, хромосом, ядерця. Ці структури забарвлюються в синьо-фіолетові кольори. Після гематоксиліном препарат поміщають в розчин еозину, який забарвлює всі інші структури клітини в рожевий колір. На рожевому тлі цитоплазми буде чітко видна контрастна фіолетова структура ядра.
Найбільші успіхи в описовій цитології були досягнуті, коли в XIX в. навчилися робити постійні, довго зберігаються пофарбовані препарати клітин і тканин. Приготування таких препаратів трудомістким і включає ряд етапів. Перший етап – взяття матеріалу для дослідження і фіксація невеликого шматочка тканини (0,5 см3). Мета цього процесу – швидко законсервувати клітини, але запобігти розпаду клітинних структур. Найчастіше в якості фіксаторів для світлової мікроскопії використовують формалін, спирт, пікринову кислоту, суміші формальдегіду з етиловим спиртом, хоча відомі складні суміші багатокомпонентних фіксаторів.
Після фіксації зі шматочка тканини потрібно приготувати тонкі зрізи товщиною 5-10 мкм на спеціальному приладі мікротому за допомогою дуже гострого металевого ножа (леза). Щоб зрізи вийшли тонкими, шматочок тканини після фіксації зневоднюють із застосуванням серії спиртів підвищується концентрації і ксилолу, потім просочують розплавленим парафіном при 56ºС. При кімнатній температурі парафін застигає, і шматочок тканини стає твердим, він готовий для приготування зрізів.
Приготовлені зрізи поміщають на предметне скло, розчиняють парафін ксилолом, поступово заміщають ксилол водним середовищем за допомогою розчинів етилового спирту спадної концентрації. Потім препарат фарбують у водному розчині барвника. Після фарбування препарат знову зневоднюють і укладають в краплю канадського бальзаму під покривне скло. Такий препарат може зберігатися дуже довго, протягом декількох років.
Сукупність прийомів і методів приготування та аналізу за допомогою світлової мікроскопії називається МІКРОТЕХНІКА.
У XX в. були розроблені світлові мікроскопи, що дозволяють більш детально вивчати живі незабарвлені клітки. Це интерференционная мікроскопія, поляризаційна мікроскопія, різноманітні приставки до звичайного світловому мікроскопу – фазово-контрастна мікроскопія і метод темного поля.
При вивченні живих клітин широко використовується люмінесцентна (флюоресцентная) мікроскопія. У люмінесцентному мікроскопі об’єкт висвітлюється ультрафіолетовим промінням, використовуються особливі барвники – флюорохромами, які при поглинанні енергії світла починають яскраво флюоресціровать. Флюорохромами можуть вибірково зв’язуватися з певними структурами клітини або макромолекулами. При такому мікроскопірованіі світяться клітинні структури виявляються на темному тлі. Роздільна здатність люмінесцентного мікроскопа така ж, як у світловому.

Посилання на основну публікацію