Методи забарвлення мікроорганізмів

Ми живемо у світі бактерій. Вони навколо нас і всередині нашого організму. Не дивно, що ми хочемо знати про них якомога більше. Але як розглянути і тим більше вивчити щось настільки маленьке?

Мікроскоп, здавалося б, повинен вирішити цю проблему. Але не все так просто – в своєму природному стані мікроорганізми прозорі як скло. «Проявити» картинку допомагають різні методи забарвлення бактерій, що допомагають досліджувати зовнішню і внутрішню будову мікробів.

Як все починалося

В кінці дев’ятнадцятого століття датський біолог Крістіан Грам запропонував вирішення цієї проблеми. Якщо щось невидимо, його потрібно пофарбувати і подивитися, що вийде. Метод забарвлення бактерій, запропонований Грамом, був настільки переконливий, що й донині мікроорганізми поділяють на грампозитивні (утримують забарвлення) і грамнегативні (що знебарвлюються після обробки спиртом).

Крістіан Грам

Як виявилося, клітини вкриті оболонкою, схожою на переплетені між собою нитки. І хоча в просвіти між нитками вільно проходять поживні речовини, необхідні клітці, оболонка надійно захищає «внутрішній світ» від зовнішніх агресивних факторів.

У різних видів бактерій зовнішня стінка клітини має різну товщину, щільність і хімічний склад.

Саме на цій властивості клітинних оболонок базується метод забарвлення за Грамом.

Відштовхуючись від робіт Крістіана Грама, біологи розробили нові методи, що дозволяють не тільки визначити форму і розмір клітин, але і розглянути деякі подробиці їх будови. Іноді мікроорганізми, абсолютно ідентичні за зовнішнім виглядом, по-різному реагують на барвники. Отримана інформація дає можливість швидко і точно визначити вид бактерій.

Старий – не означає поганий

Мабуть, самий практичний і широко застосовуваний спосіб фарбування мікроорганізмів – метод Грама. Мазок, зафіксований вогнем, покривають метиловим фіолетовим барвником, фіксують йодом, просушують і промивають спиртом. На цьому етапі, в залежності від властивостей клітинної мембрани, бактерії стають:

  • яскраво-синіми (грампозитивні);
  • безбарвними (грамнегативні).

Забарвлення мікроорганізмів за Грамом

Товщина оболонки клітин, що залишилися безбарвними, не дозволяє фарбі проникнути всередину, і вона легко змивається з поверхні бактерій. Останнім кроком фарбування за Грамом є використання червоного барвника, він залишається на поверхні клітинної мембрани і надає їй рожевий або червоний відтінок.

Грампозитивні бактерії, як правило, небезпечні для людини.

До цієї категорії відносяться:

  • стрептококи;
  • стафілококи;
  • бацили;
  • клостридії і т. д.

Грамнегативні не так небезпечні. Вони теж можуть викликати хвороби і запалення, але тільки за певних умов. Таким чином, просто приготувавши забарвлений препарат, можна отримати уявлення про ступінь небезпеки досліджуваних мікроорганізмів.

Вітальні методи забарвлення

Станом досліджуваних організмів в мікробіології існують:

  • вітальний спосіб, тобто робота з живими бактеріями (небезпечний, вимагає суворого дотримання техніки безпеки);
  • поствітальний метод – робота з фіксованими (убитими) клітинами;
  • негативний, може бути вітальним і поствітальним, зручний для роботи з капсулами.

Вітальний метод забарвлення бактерій

Вітальний метод, безумовно, найнебезпечніший, оскільки дослідникам доводиться мати справу з живими клітинами, які іноді представляють смертельну небезпеку. Однак саме такий спосіб дає можливість вивчати не тільки будову клітини, але і весь її життєвий цикл і взаємодію з оточенням.

Для багатьох мікробіологічних досліджень важливо зберегти бактерії живими. Це означає, що потрібно використовувати спеціальні нетоксичні або низькотоксичні барвники, до того ж легко проникаючі у структуру клітини через зовнішню оболонку. Це так звані вітальні барвники, вони можуть бути призначені для видимого світла або флуоресцентними. За хімічним складом барвники поділяються на:

  • основні (акридіновий оранжевий, метиленовий синій);
  • кислотні або кислі (індигокармін, кислий фуксин);
  • нейтральні (родамін В).

Робота з фіксованими препаратами

За складністю роботи методи забарвлення фіксованих (неживих) клітин поділяються на:

  • Прості методи. У цьому випадку використовують тільки одну фарбу, як правило, червону (фуксин) або синю (метиленовий синій). Різниця між цими барвниками полягає в швидкості впливу. Фуксин дає результат вже через 1-2 хв., тоді як результат роботи синьої фарби потрібно чекати 3-5 хв. Використовувати розчин фуксину в карболовій кислоті (т. зв. фуксин ціля) зручно ще й тому, що приготований препарат протягом декількох місяців не втрачає забарвлюючих властивостей. Метиленовий синій барвник теж може бути підготовлений заздалегідь в міцному спиртовому розчині.
  • Складні (диференціальні) методи. Тут потрібно кілька барвників (мінімум два), що мають різний колір. Це дозволить не просто побачити бактерії, але і докладніше вивчити їх внутрішню будову, так як різні ділянки клітини можуть по-різному сприймати барвники. До складних відносять методи Грама, Ціля – Нільсена (для кислотостійких бактерій), Беніньетті (забарвлення бактеріальних джгутиків), Гінса (виявлення капсул), диференціюючий метод Романовського – Гімзи (забарвлення спор) і деякі інші.

Особливо важливі складні методи для діагностики інфекційних захворювань, наприклад, спосіб забарвлення Нейссера допомагає відрізнити дифтерійну паличку від псевдодифтерійної.

Диференціюючий спосіб Романовського – Гімзи заснований на застосуванні спеціального готового порошку, на основі якого лабораторії готують розчин барвника потрібної концентрації. Перевага цього способу в тому, що цитоплазма і ядро ​​клітини отримують різне забарвлення, що полегшує ідентифікацію та вивчення мікроорганізмів.

Метод Нейссера використовують у медицині для виявлення зерен волютину (гранул із запасом їжі для багатьох прокаріотів клітин) у збудників дифтерії. У результаті фарбування бактерія набуває жовтий колір, а гранули волютину – синій.

Білим по чорному

Ще один різновид забарвлення бактерій заснований на властивостях негативу, тобто на темному фоні препарату чітко видні безбарвні бактерії, іншими словами, забарвлюється середовище, а не сам організм.

Іноді бактерії, потрапляючи в певні умови, утворюють капсули. Це слизові утворення, що покривають клітку, чимось схожі на гель. Капсули прозорі, їх хімічний склад може сильно відрізнятися у різних видів бактерій, тобто просто пофарбувати і оцінити результат за отриманим кольором не вийде.

Крім того, капсули м’які і неміцні, при фарбуванні вони можуть втратити форму.

Фарбувальні речовини погано взаємодіють з желеподібною структурою капсул і легко вимиваються при обробці. Щоб виявити, але не пошкодити капсули, стане в нагоді негативний спосіб фарбування.

Одним із способів виявлення капсул є метод фарбування по Гінсу. Краплю чорної туші наносять на край предметного скла, вносять до неї досліджуваний матеріал, перемішують і розподіляють по всій поверхні. Мазок сушать на повітрі, фіксують і забарвлюють фуксином Циля. Через 2-3 хвилини промивають водою і висушують. В результаті під мікроскопом на загальному темному тлі чітко проглядаються рожеві клітини, оточені прозорими капсулами.

Забарвлення спороутворюючих бактерій

Якщо говорити про клітинні оболонки, то не можна не згадати про спороутворюючі бактерії. Спори утворюються при несприятливих для клітини умовах і можуть існувати в агресивному середовищі досить тривалий час. Те, що добре для збереження клітини, погано для її вивчення. Спори дуже щільні і майже не пропускають рідини, крім того, вони кислотостійкі. Отже, просте фарбування або метод Грама залишать спори безбарвними.

Перед початком фарбування доводиться хімічно обробляти поверхню спори, щоб вона трохи змінила свою структуру і дозволила барвним речовинам проникнути всередину. При цьому забарвлюється і вся цитоплазма клітини. Щоб знебарвити цитоплазму, препарат промивають і висушують. Фарба в спорах, завдяки їх більш щільній структурі затримується краще, ніж в цитоплазмі.

Способи забарвлення спор можуть бути різними, наприклад, Ожешко або Циля-Нільсена, але всі вони зводяться до однієї схеми:

  • розпушення поверхні спор хімічними речовинами (кислоти, аміак, їдкий натр);
  • фарбування клітини зі спорою (зазвичай при нагріванні);
  • знебарвлення цитоплазми.

В результаті отримуємо відмінно видиму яскраво забарвлену спору і бліду, майже прозору цитоплазму.

Як розглянути бактеріальні джгутики

Ще одна непроста задача – забарвлення бактерій з джгутиками. Це спірально закручені дуже тонкі нитки, які мікроорганізми використовують для переміщення. Джгутики надзвичайно тонкі, при фарбуванні вони легко відриваються від клітини. Тому перед початком фарбування джгутики протравлюють, штучно збільшуючи в обсязі.

При підготовці мікроорганізмів до дослідження бактеріальну культуру кілька разів пересіюють на свіже живильне середовище протягом декількох днів. Потім бактерії з джгутиками переносять в пробірку зі стерильною водою (t = 37⁰С). Роблять це гранично обережно, не перемішуючи рідину, щоб не пошкодити джгутики.

Вміст пробірки залишають приблизно на годину, щоб бактерії рівномірно розподілилися по всьому об’єму. Перед початком дослідження перевіряють рухливість клітин в висячій краплі. Якщо руху немає, пробірку залишають ще на деякий час.

При нанесенні розчину на предметне скло клітини можуть легко втратити джгутики.

Тому поверхня скла повинна бути ідеально чистою і знежиреною. Перед нанесенням крапель розчину предметне скло проводять над гарячою частиною полум’я пальника, щоб потрапили на поверхню краплі розпливлися і швидко висохли.

Після висихання мазок протравлюють, через 15 хвилин хімікат змивають. Наступний етап – забарвлення фуксином – проводять, занурюючи скло в розчин барвника, щоб не пошкодити джгутики при нанесенні фарби.

Витримавши потрібний час, мазок промивають водою і висушують. Тепер можна переходити до дослідження отриманого результату.

Техніка фарбування

Для отримання пофарбованого препарату не можна просто взяти пензлик, фарби і відловити бактерію. Існує певна схема роботи з мікроорганізмами:

  • Приготування мазка. На предметне скло (стерильне) наносять краплю води, в яку потім бактеріологічною петлею вносять і розподіляють по поверхні лабораторний матеріал.
  • Висушування. Зайва рідина висушується або природним шляхом при кімнатній температурі, або мазок трохи прогрівається високо над полум’ям пальника.
  • Фіксація. Мало просто прибрати воду, потрібно закріпити бактерії на предметному склі. Для цього можна використовувати вогонь (кілька проходів над найгарячішою частиною полум’я) або рідина (спирт, ацетон). Після такої обробки мікроорганізми швидше вбирають фарбу.
  • Безпосередньо фарбування. Фарба повинна повністю покривати всю поверхню мазка. Витримавши потрібний час (для кожного барвника свій), фарбу прибирають і промивають препарат водою.

Після висихання (зазвичай природним шляхом) отриманий результат можна використовувати за призначенням.

Фарбування мікроорганізмів – це ціла система методів, прийомів, схем, спрямованих на виявлення і розпізнавання клітин за допомогою мікроскопа. Жодне медичне дослідження або наукова робота в мікробіології не обходяться без попередньої підготовки й забарвлення досліджуваного матеріалу.

Посилання на основну публікацію