Клітинна біотехнологія

Це важливий напрямок новітньої біотехнології склалося в кінці 60-х – початку 70-х років на базі методу культур і тканин, що розвивалося з кінця XIX століття в основному як експериментальний метод. Культивування клітин рослин і тварин – важливий інструмент досліджень і в сучасній біології.

Без цієї техніки неможливе створення тварин і рослин з клітин, отриманих методами генетичної і клітинної інженерії, на ній засноване мікроклональне розмноження рослин, вона використовується в тваринництві в репродукції тварин, ці методики докладніше розглянуті нижче.

Використання клітинних культур тварин має невелику передісторію. Спочатку у виробництві вакцин як субстрат для розмноження вірусів використовували тканини тварин, однак для отримання складних вакцин і підвищення стабільності процесів були розроблені клітинні культури. У 50-х роках, коли виникла гостра необхідність у вакцині проти поліомієліту, в її виробництві використовували культуру клітин нирок мавп. Але там виявили ендогенні віруси, які потрапляли в вакцину. Тоді почали використовувати диплоїдні клітини людини. Незабаром були розроблені методи вирощування клітин тварин в достатніх кількостях. І зараз виробництво вакцин – найбільша область застосування культур клітин тварин.

Друга давня область застосування культур клітин тварин – лабораторні дослідження. Зокрема, їх використовували для випробування ліків, харчових добавок і т. Д. Застосовувані для вирощування таких культур методи були дуже складними і це було швидше мистецтвом, ніж технологією.

В останні два десятиліття розвинулося від лабораторної технології до великомасштабного виробництва промислове культивування клітин тварин. Цей метод дозволяє реалізувати на практиці багато досягнень генної та клітинної інженерії в новітніх біотехнологічних виробництвах.

Для організації рентабельних стабільних великомасштабних виробництв з використанням клітин тварин треба було вирішити ряд складних проблем, які здавалися нездоланними. Ці клітини – дуже крихкі і легко пошкоджуються при перемішуванні, володіють низькою продуктивністю в порівнянні з бактеріями, повільно ростуть, вимагають складних і дорогих середовищ, вони не були достатньо вивчені, процеси з їх використанням вимагають складного технологічного оформлення та ефективного контролю. Взаємодія багатьох наук і зусиль технологів і розробників апаратурного оформлення процесів, використання досягнень генної інженерії привели до того, що в 80-х – 90-х роках вдалося подолати більшість з перерахованих перешкод.

Одним з головних завдань було створення культур клітин – ефективних продуцентів бажаного продукту. У природних умовах клітини тварин (за деякими винятками) виробляють мало білка, повільно ростуть. Продуктивність клітин іноді вдається підвищити за допомогою генної інженерії. Так, за рахунок ампліфікації (багаторазового копіювання в клітці) генів, що відповідають за синтез даного білка, вдається підвищити його синтез. Однак такі клони часто нестабільні і погано ростуть. Створюються також рекомбінантні клітини, в яких штучно викликається експресія гена, відповідального за синтез білка. Для цього використовуються регуляторні послідовності різних вірусів.

Одна з найскладніших проблем – підбір поживних середовищ для вирощування культур клітин тварин. Традиційно клітинні культури вирощували на сироватках тваринного походження (лімфа, плазма, пізніше – ембріональна рідину і т. Д.). Ця сировина дорого, непостійно за складом (склад від партії до партії істотно змінюється), містить багато сторонніх білків (що ускладнює процес виділення готового продукту). Більш того, важко виключити можливість зараження сировини різними вірусами, які можуть потрапити і в готовий продукт. Наприклад, ринок сировини для виробництва вакцин в Англії був зруйнований після того як з’ясувалося, що вірус коров’ячого сказу викликає серйозне захворювання у людини.

Уже в 50-х роках, коли почало виникати великомасштабне виробництво вакцин, здійснювалися спроби створити середовища певного складу. Одним з перших Г. Ігл [[46]] розробив середу складного складу – суміш амінокислот, мінеральних речовин, вітамінів, вуглеводів, містить 20% сироватки (без цього не вдавалося забезпечити задовільний ріст клітин). На таких середовищах здійснюються багато виробництв клітинної біотехнології. Однак нові виробництва розробляються вже на середовищах повністю контрольованого складу, що не містять сироватки, такі середовища доступні в даний час для більшості типів клітин.

При переході до великомасштабних виробництвам виникла необхідність удосконалити технологію і апаратурне оформлення процесу культивування.

До недавнього часу клітини тварин культивували в монослойной глибинній культурі з низькою щільністю в ферментерах, створених для культивування мікроорганізмів. Зараз розроблені спеціальні ферментери для великомасштабного культивування клітин тварин з високою щільністю. Як і в мікробіологічної промисловості, існує багато різних технологічних рішень (ферментери з перемішуванням, ерліфтні, турбінні та ін.). Клітини дуже чутливі до механічних напруженням, тому їх часто иммобилизуют – прикріплюють до поверхні різних носіїв – порожнистих волокон, керамічних картриджів, скляних носіїв, микроносителей і т. Д. Використання микроносителей (мікросфер діаметром від 100 до 400 мкм), особливо макропористий, в яких до 40% внутрішнього об’єму заповнюється клітинами, дозволяє захистити клітини від механічного пошкодження і вирощувати їх в суспензії. Використовуються також клітини, укладені в капсули, клітинні агрегати.

Все ширше використовується безперервне культивування, хоча багато важливі промислові процеси (наприклад, виробництво ерітропойетіна) здійснюються періодично. Це обумовлено, зокрема, проблемою генної стабільності клітин і можливістю зараження, що обмежує максимальну тривалість їх безперервного культивування.

При промисловому культивуванні клітин тварин проблема контролю та управління ще складніше і важливіше, ніж в традиційній біотехнології, так як клітини більш чутливі і менш стабільні, ніж мікроорганізми. Для раннього виявлення відхилень необхідно здійснювати постійний моніторинг умов культивування та стану клітин. Для цього використовують останні досягнення сучасної технології (ядерно-магнітний резонанс і лазери для визначення життєздатності, розмірів і кількості клітин у культурі, моноклональні антитіла для імунологічного аналізу і т. Д.). Проте і зараз проблему контролю можна вважати вирішеною, не всі важливі параметри можна виміряти існуючими методами.

Велике значення для контролю має розробка математичних моделей. Вона здійснюється на основі моделі Моно – Ієрусалимського, і вимагає глибокого вивчення метаболізму клітин. Додаткова складність моделювання обумовлена ??гетерогенністю систем – різними умовами в різних частинах сучасного ферментера з високою щільністю культури.

Найважливіша стадія промислового процесу – виділення, очищення та стандартизація готового продукту. Вартість цих “хвостових” стадій складає в біофармацевтичної промисловості 70-80% ціни продукту, тому рентабельність процесу багато в чому визначається цими стадіями, вони ж грають вирішальну роль у безпеці продукту. Через лабільності продукту застосовні тільки м’які методи виділення та очищення, що важко поєднувати з вимогою отримання стерильного апірогенної продукту. Важливе завдання – визначення отриманого продукту, для цього використовуються біологічні тести, тести на визначення шкідливих домішок, на ідентичність білка (в тому числі, імунологічний аналіз, частковий аналіз послідовностей ДНК). Всі ці тести дуже складні і дороги.

Всі стадії процесу, як завжди в біотехнології, взаємопов’язані, тому здійснюється інтегроване проектування процесу – одночасна оптимізація серії взаємодіючих операцій, із задоволенням найсуворіших вимог безпеки.

Посилання на основну публікацію