Неоднакова інтенсивність включення міченого попередника в РНК хромо- і амілопласти коренеплодів моркви свідчила про суттєві зміни у функціонуванні пластид в залежності від спеціалізації в накопиченні запасних речовин. У зв’язку з цим представляють інтерес результати фракціонування сумарних РНК досліджуваних пластид коренеплодів білої і червоної моркви.
Електрофоретичний поділ немічених РНК
Відомо, що основними фракціями хлоропластних РНК, які виявляються при електрофорезі в поліакриламідному гелі, є рибосомні 23 S і 16S РНК, а також 4-5S РНК, що складається з транспортних і низькомолекулярних Хвороби. Крім того, іноді дослідникам вдавалося виявити РНК, мігруючу в ПААГ трохи швидше 16S РНК. Мабуть, ця РНК відповідає мРНК бистрообращающегося тілакоідного білка з молекулярною масою 32 000 дальтон. На відміну від хлоропластів вищих рослин і водоростей амілопласти бульб картоплі не містять Хвороби. Сумарна амілопластная РНК бульб картоплі представлена гомогенним піком низкомолекулярной РЖ, коефіцієнт седиментації якої 4,2S.
Амілопласти бульб картоплі не містять Хвороби. Для фракціонування сумарних препаратів РНК найчастіше застосовується електрофорез в гелях з низькими концентраціями полиакриламида (2,0-3,0%). Такі гелі мають драглисту консистенцію і легко розриваються при маніпуляціях з ними. Тому для поліпшення механічних характеристик таких гелів і для полегшення аналізу рибонуклеїнових кислот ми використовували змішані агароза-поліакриламідні гелі з концентрацією агарози 0,5%. Агароза в концентраціях 0,2-0,5% утворює сітку з порами, які не заважають просуванню рибонуклеїнових кислот. Таким чином, в змішаних агароза-поліакриламідних гелях поділ РНК відбувається тільки за рахунок тертя молекул зі стінками грат, утворених акриламидом і метилен-біс-акриламидом. При цьому агароза забезпечує щільність і жорсткість гелів, роблячи їх зручними для досліджень. Оскільки 23S РНК пластид рослин характеризується нестабільністю в відсутності двовалентних катіонів, виділення РНК аміло і хромопластов коренеплодів білої і червоної моркви і аналіз їх методом електрофен різу проводили в присутності хлористого магнію.
Фракційний склад сумарного препарату РНК хромопластов моркви сорту Харківська Нантская (1) і амілопласти моркви сорту Біла зеленоголова (2): а – початок, б – середина, в – кінець вегетації. Результати дослідження фракційного складу РНК хромопластов формуються коренеплодів моркви сорту Харківська Нантская свідчать про наявність в них молекул, мігруючих при електрофорезі в області 23S і 16S Хвороби, а також в районі 4-5S РНК. Подібні картини розподілу спостерігалися також при дослідженні РНК хромопластов, виділених з коренеплодів в середині і в кінці вегетаційного періоду (рис. 1).
Амілопласти формуються коренеплодів моркви сорту Біла зеленоголова також містили 23S, 16S і 4-5S РНК. Однак в амилопластах, виділених з коренеплодів білої моркви в середині і в кінці вегетації, рибосомні 23S і 16S РНК були відсутні і сумарна амілопластная РНК була представлена низкомолекулярной фракцією, схожою за електро-форетічеського рухливості з 4.2S РНК амілопласти запасающих тканин бульб картоплі. Для з’ясування можливості деградації високомолекулярних Хвороби в процесі її виділення були проведені додаткові дослідження по вивченню РНКазной активності хромо-і амілопласти. При виділенні аміло і хромопластов моркви ми використовували додецилсульфат натрію. Відомо, що цей детергент пригнічує нуклеази, в тому числі і РНКази. Крім того, в лізуючого середу ми вносили полівініл-сульфат, який також є інгібітором РНКазной активності. Визначення РНКазной активності пластид запасающих тканин коренеплодів білої і червоної моркви проводилося в середовищах для виділення РНК під час відсутності і в присутності зазначених інгібіторів.
В основу визначення РНКазной активності була покладена пропис B.Srivastava І G.Ware, в яку були внесені деякі зміни, пов’язані зі специфікою досліджуваних об’єктів. Кількість пластид в пробах і кратність розведення проб підбирали з таким розрахунком, що оптичне поглинання кінцевого розчину знаходилося в межах 0,4-0,6 при дослідженні хромопластов до формуються коренеплодів (діаметр 3-5 мм). Результати досліджень показали, що амілопласти володіють більш низькою РНКазной активністю в порівнянні з Хромопласти. Більш того, РНКазная активність ізольованих амілопласти помітно знижувалася до кінця вегетаційного періоду, тоді як її величина в хромопласти істотно не змінювалася в онтогенезі коренеплодів рослин червоної моркви. Додавання в середу додецилсульфата натрію помітно пригнічувало РНКазную активність в обох типах пластид, однак при цьому вона ще зберігалася на досить високому рівні (22-35 од. Активності на 4 * 109 пластид для амілопласти і. 108-120 – для хромопластов).
Одночасне додавання додецилсульфату натрію і полівініл-сульфату, як нами зазвичай робилося відповідно до методики виділення РНК, повністю інгібувати РНКазную активність в обох типах пластид. Слід зазначити, що використовуваний метод визначення РНКазной активності по оптичному поглинанню надосадової рідини, запропонований B.Srivastava і G.Ware, не досконалий, оскільки не виключає можливості випадання в осад частини фрагментів РНК. Тому наявність РНКазной активності визначали додатково по гіперхромних ефекту обложеної РНК. Г.Д.Кречетова і співавт. показали чутливість цього методу. Його використання дозволяє виявити наявність РНКазной активності навіть тоді, коли вона не виявлялася виміром поглинання надосадової рідини.
Дослідження показали, що випала в осад РНК, оброблена ферментним препаратом з пластид, що не містить інгібіторів нуклеазного активності, має низький гіперхромний ефект. У той же час РНК, оброблена ферментним препаратом, що містить додецилсульфат натрію, зберігала близько 80% гіперхромізма, а РНК, оброблена ферментним препаратом, що містить додецилсульфат натрію спільно з полівініл-сульфатом, по гіперхромних ефекту не відрізнялися від контролю. Результати дослідження РНКазной активності по оптичному поглинанню надосадової рідини і гіперхромних ефекту обложеної РНК показали, що введення в середу для виділення РНК додецилсульфата натрію і полівініл-сульфату повністю пригнічує РНКазную активність.
Отже, низькомолекулярна РНК в амилопластах коренеплодів білої моркви не є продуктом деградації високомолекулярних Хвороби в процесі її виділення. Крім того, наші результати вказують на відсутність серед переважаючих компонентів хромопластной РНК молекул, інших, ніж 23 S, 16S і 4-5 S РНК. Таким чином, дослідження показали, що хромопласти коренеплодів червоною моркви, як і хлоропласти листя вищих рослині і водоростей містять Хвороби. У той же час амілопласти коренеплодів білої моркви в процесі вегетації втрачають Хвороби. При цьому в них виявлена низькомолекулярна РНК, подібна за електрофоретичної рухливості з 4,2S РНК, виявленої в амилопластах бульб картоплі.