Фіксація клітинної структури

Для вивчення клітини необхідно якимось способом підсилити розбіжності у показниках заломлення різних клітинних структур. Один із способів полягає в тому, щоб обробити клітку барвниками або солями металів, здатними вибірково зв’язуватися з важливими нас компонентами. Ці речовини щодо непрозорі для деяких довжин хвиль, і тому забарвлені клітинні структури легко спостерігати під мікроскопом. Як правило, клітку перед фарбуванням необхідно фіксувати, і при цьому ми стикаємося з великими труднощами. Мета фіксації полягає в тому, щоб перевести клітку в полутвердое стан, що дозволяє експериментатору маніпулювати з нею (приготовляти зрізи, фарбувати, зміцнювати зрізи на предметному склі і т. д.); в той же час фіксація не повинна приводити до повної втрати природної структури клітини. На жаль, зазвичай вживані методи фіксації викликають дуже сильне огрубіння клітинних структур. Як правило, стабілізація цих структур досягається зневодненням препарату, а також денатурацією містяться в клітинах білків (завдяки чому придушуються всі види ферментативної активності, які могли б в іншому випадку привести до саморуйнування клітини). Процес дегідратації закінчується зазвичай тим, що вода заміщується какімлібо іншим більш жорстким і легко видаляється з зрізів речовиною. Безсумнівно, що»нативна»клітина не містить денатурованих білків і наведених розчинників. В результаті нас постійно турбує думка про те, чи не є спостережувані під мікроскопом структури артефактом, що виникли під час проведення процедур, що передували спостереженню.

Постійні зусилля, спрямовані на поліпшення методом фіксації або її повне виключення з процедури приготування препаратів, привели до розробки технічних прийомів, які дуже допомогли у вивченні будови клітини. Найбільш важливим з них з’явився метод ліофільної сушіння, що дозволяє зберігати нативну структуру клітини. Матеріал, що підлягає дослідженню, при цьому швидко заморожують до дуже низької температури (зазвичай з цією метою використовують рідкий азот) і потім (у той час як матеріал знаходиться в твердому стані) міститься в ньому воду видаляють за допомогою сублімації. (Швидкість випаровування можна збільшити, помістивши препарат у вакуум.) Безперервне випаровування води забезпечує підтримання низької температури, і, таким чином, весь об’єкт знаходиться в замороженому стані аж до його повного зневоднення (ліофілізації). Великою перевагою даного методу фіксації є та обставина, що видалення води з клітини та отримання сухого і досить твердого препарату досягаються без використання дегідратірующіх агентів, які легко денатурують білки. Ліофілізовані клітини могуть бути знову зволожені і доведені до кімнатної температури. Оскільки при цьому спостерігається повне відновлення всіх біологічних функцій клітини, то очевидно, що даний метод повністю зберігає її нативне будову. Цей висновок справедливий по відношенню до настільки різним біологічним об’єктам, як спори бактерій і сперма бика. (Використання даного методу в останньому випадку дає великий економічний ефект.) Таким чином, очевидно, що в даний час вдалося розробити майже ідеальний метод фіксації і що для вивчення структури клітини вже немає необхідності використовувати процедури, які призводять денатурацію містяться в ній білків.

З іншого боку, для приготування зрізів (що потрібно в багатьох випадках, і зокрема для електронної мікроскопії) досліджуваний об’єкт все ще необхідно просочувати та укладати у відповідне середовище, замещающую раніше присутню в ньому воду. Ступінь пошкоджень, що викликаються заливкою препарату, досить точно не визначена. Ми погано знаємо також, що відбувається при взаємодії барвників з ліофілізованим матеріалом, проте, зіставляючи будова забарвлених і нефарбованих клітин, вдалося отримати досить значну інформацію про що відбуваються при цьому процесах. Ймовірно, найбільш важливий факт, отриманий за допомогою методу ліофільної сушіння, полягає в тому, що в ліофілізованих препаратах спостерігаються ті ж структури, які виявлені раніше за допомогою менш сучасних методів. Тому ми можемо бути впевнені, що спостерігаються в забарвлених препаратах структури не є артефактом, а реально присутні в інтактних клітинах. Поряд з іншими висновками цей факт призводить до висновку, що структура клітини значно більш впорядковано і стабільна, ніж це можна було припустити на підставі перших спостережень живих клітин, проведених за допомогою світлового мікроскопа, роздільна здатність якого відносно мала. Природа клітини, очевидно, дозволяє їй з успіхом протистояти вельми сильним впливам.

Посилання на основну публікацію