Ендонуклеаза

ДНКаза I

Ця ендонуклеаза розрізає одно-і двухланцюгова ДНК. Вона гидролізуєфосфодіефірние зв’язку, утворюючи моно-і олігодезоксірібонуклеотіди з 3′-ОН і 5 `-фосфатними кінцями.

Особливості:

1) активність ферменту суворо залежить від іонів Са2 + і активується іонами Mg2 + або Mn2 +;

2) у присутності Mg 2 +, ДНКаза I розщеплює кожну нитку дцДНК окремо випадковим чином;

3) у присутності іонів Mn2 + фермент розщеплює обидві ланцюга ДНК приблизно в тому ж місці, утворюючи фрагменти ДНК з тупими кінцями або зі звисами довжиною в один-два нуклеотиди;

4) ДНКаза чутлива до фізичної денатурації, тому перемішуйте фермент м’яко, не струшуйте.

Область застосування:

1) підготовка розчину з РНК, що не містить ДНК;

2) видалення матриці ДНК в пробірці перед транскрипцією in vitro;

3) підготовка розчину з РНК, що не містить ДНК перед ОТ-ПЛР;

4) ДНК-маркування методом нік-трансляції за сприяння ДНК-полімерази;

5) дослідження ДНК-білкових взаємодій з ДНКаза;

6) створення бібліотек випадково перекриваються инсерций ДНК. Використовується реакційний буфер, що містить Mn2 +.

Інгібування і інактивація

ЕндонуклеазиІнгібітори: хелатирующие агенти, перехідні метали (наприклад, Zn) в мілімолярних концентраціях, ДСН (навіть у концентраціях менше 0,1%), відновники (ДТТ), іонна сила вище 50-100 мM; інактивується нагріванням при температурі 65 ° С протягом 10 хвилин у присутності ЕДТА (використовується принаймні 1 моль ЕДТА на 1 моль Mg 2 +/Mn2 +).
Ендонуклеаза IV, E. coli (Endо 4)

Ендонуклеаза IV дізнається апуріновие/апірімідіновие (AP) ділянки двухцепочечной ДНК і розщеплює фосфодіефірную зв’язок, утворюючи гідроксильні групи на 3 `-кінці. Ендонуклеаза може діяти як естераза, отщепляя 3 `-фосфогліколат і 3`-фосфат c пошкоджених кінців двухцепочечной ДНК. Ендонуклеаза IV володіє також 3 `? 5` екзонуклеазной активністю.

Особливості:

1) її активність на субстраті чутлива до іонної силі, іонів металів, ЕДТА, а також до відновників;

2) субстрати з віддаленими 3 `- кінцями є переважно субстратами для 3` ? 5 `екзонуклеазной активності;

3) фермент не вимагає наявності Mg2 +, але більш активний у його присутності.
Область застосування:

1) вивчення пошкоджень ДНК і її репарацію;

2) електрофорез однієї клітини;

3) дослідження протипухлинних препаратів;

4) дослідження структури ДНК;

5) аналіз одиночного нуклеотидного поліморфізму (ОНП).

10Х Реакційний буфер

100 мМ Тріс-HCl (рН 8,5 при 25 ° С), 25 мМ MgCl2.

Інгібування і інактивація

Інгібітори: фермент досить стійкий до ЕДТА в ході реакції, але стає чутливим навіть до субмілімолярним кількостей хелатирующих агентів, коли немає матриці ДНК; інактивується нагріванням при 80 ° С протягом 15 хв.

Посилання на основну публікацію