Використання поліморфних ДНК-маркерів

Метод «ДНК-відбитків» може виявитися корисним і при встановленні відмінностей між рослинними культурами. Один з варіантів цього методу заснований на використанні поліморфних ДНК-маркерів для ампліфікації випадкових фрагментів (random amplified polymorphic DNA, RAPD). Для цього беруть довільні праймери довжиною 9-10 нуклеотидів, що не містять паліндромний послідовностей і мають GС-зміст 50-80%, і додають їх окремо до препаратів хромосомної ДНК рослин. Кожна ПЛР ініціюється одним праймером, який повинен бути здатний зв’язуватися з обома ланцюгами ДНК-мішені. Нуклеотидні послідовності всіх олігонуклеотидів відомі, але який з них виявиться ефективним ініціатором ПЛР, неясно. Якщо праймер гибрідизуючою з обома ланцюгами ДНК-мішені у відповідній орієнтації і сайти розташовані на відстані від 100 до 3000 п. Н. один від одного, то фланковані ними сегмент ДНК буде ампліфікувати, а отриманий фрагмент можна виділити за допомогою гель-електрофорезу і візуалізувати фарбуванням. Число різних фрагментів ДНК, що утворюються при ампліфікації, залежить від праймера і геномної ДНК. Для одних і тих же праймера і ДНК-мішені продукти ампліфікації будуть щораз однаковими, а заміна лише одного нуклеотиду в праймерів призведе до повної зміни набору одержуваних фрагментів. Таким чином, використовуючи один і той же набір олігонуклеотидних праймерів, можна порівнювати RAPD- «ДНК-відбитки» різних рослинних культур, а отже, і самі культури. Для виявлення відмінностей між двома дуже близькими сортами або культурами рослин часто доводиться використовувати кілька довільних праймерів з відомою нуклеотидної послідовністю. Як і всі інші молекулярні маркери, RAPD можна застосовувати для характеристики цілих геномів, окремих хромосом або генів.

У порівнянні з іншими методами ідентифікації складних ДНК метод RAPD володіє наступними перевагами: 1) для всіх видів рослин можна використовувати один і той же (універсальний) набір олігонуклеотидних праймерів; 2) не потрібно створювати геномні бібліотеки, використовувати радіоактивні зонди, проводити гібридизацію, т. Е. Можна легко і швидко охарактеризувати велику кількість зразків; 3) процес можна автоматизувати. Крім того, для проведення звичайної ПЛР необхідно знати нуклеотидную послідовність шуканого гена або його фрагмента – мішені для ампліфікації. У разі ж RAPD амплифицируют будь-яку ділянку генома, що містить дві комплементарні праймеру послідовності, які фланкируют сегмент ДНК довжиною від 100 до 3000 п. Н.

За допомогою методу RAPD вдалося відрізнити один від одного шість інбредних ліній кукурудзи і показати, що ПЛР-продукти гібридів кукурудзи являють собою поєднання ПЛР-продуктів батьківських інбредних ліній. RAPD-маркери використовували також для скринінгу різних штамів грибів Leptosphaeria maculans, що викликають захворювання «чорна ніжка» у хрестоцвітних. Було встановлено відмінність між невірулентние (не приводять до розвитку хвороби) і вірулентним (викликає захворювання) штамами.

Посилання на основну публікацію