Відбір і аналіз YAC клонів з ДНК людини

Методом TAR-клонування було отримано 1806 первинних трансформантов. Багатоступінчастий скринінг, що включає генетичну селекцію, гібридизацію колоній in situ з міченої тотальної ДНК людини і inter-Alu-PCR, показав, що 76 з них містять вставку ДНК людини. Оскільки тотальна ДНК клітин соматичного гібрида містить 0.05% ДНК людини, а вихід клонів 7р серед TAR трансформантов склав 4,2%, що на два порядки вище, очевидно, що обраний метод TAR-клонування виявився приблизно в 100 разів ефективніше традиційного.

Розмір клонованих фрагментів склав від 100 до 900 т.п.н. Аналіз inter-Alu PCR продуктів показав відсутність перекриттів вставок, що свідчить про випадковий розподіл клонів по хромосомі. Виходячи з розмірів і кількості УАС-клонів, бібліотека містить сумарно близько 12 млн пар основ, що становить 20% короткого плеча хромосоми 7. Субтеломерние області хромосом людини містять ARS-послідовності (Flint et al., 1997), цей факт міг би підвищити ймовірність клонування кінців хромосом TAR-вектором, що не містить ARS дріжджів.

Вивчення кінців хромосом є необхідним етапом у визначенні меж фізичної і генетичної карт хромосом будь-яких геномів. Клонування кінців хромосом представляло певні складності і перші фагів і космідние бібліотеки практично не містили теломерна послідовностей. Застосування методу “напів-УАС” для клонування кінців хромосом дуже занадто багато роботи. У цій роботі лише один YAC з 600 “напів-УАС” клонів був строго локалізована в області теломери 7q. У більш пізній роботі для відбору 40 YAC клонів, які представляють 31 кінець хромосом, довелося аналізувати 12 000 первинних трансформантов.

Пошук термінальної послідовності короткого плеча хромосоми 7 людини в ДНК УАС-клонів проведено нами методом ПЛР з парою прай-рів (D1 і D2), які утворюють ПЛР-продукт розміром 246 п.н. при ампліфікації ДНК соматичного гібрида з коротким плечем хромосоми 7, і не утворюють продукту з ДНК дріжджів, миші і соматичного гібрида, що містить 7q. Чотири УАС-клону, позитивних в реакції з D1-D2, локалізовані в 7р21, 7р15.1-7р15.3, 7р15.1-7р15.2, 7р15.1-7р15.2 областях хромосоми 7 методом флуоресцентної in situ гібридизації (FISH ) з метафазну хромосомами людини продуктів Alu-PCR ДНК УАС-клонів. Отже, ці клони не є фрагментами теломери 7р, а лише містять гомологічні послідовності, які виконують функцію теломерна решт в YAC. Цей тип YAC становив основний генетичний шум, на тлі якого вівся пошук клонованих термінальних послідовностей людини у всіх роботах з векторами, що мають тільки одну теломер.

Механізм утворення структури, що функціонує на кінці штучної хромосоми дріжджів, мало вивчений. Відомо, що такі послідовності часто зустрічаються в геномі еукаріотів і локалізуються, зокрема, у людини в різних, нетермінальних сегментах хромосом. Такі кінці мають структурної нестабільністю: у процесі реплікації і розмноження клонований фрагмент може істотно зменшуватися. Після декількох пасажів поряд з лініями клітин, які мають первинний YAC, нами виявлені лінії з YAC меншого розміру. Подібні факти відмічені і в інших роботах.

Для більш спрямованого пошуку теломерна і субтеломерних клонів ми використовували 5 пар STS праймерів як тестів на послідовності, розташовані на різній відстані від теломери хромосоми 7р (до 300 т.п.н). ПЛР продукти були виявлені з трьома послідовно розташованими праймерами в ДНК YAC 24-17. Отже, цей YAC містить термінальний фрагмент короткого плеча 7 хромосоми. Локалізація клону YAC 24-17 на термінальному ділянці 7р хромосоми підтверджена методом FISH. ДНК даного клону гибрідизуючою також з декількома, переважно термінальними, районами інших хромосом: 7cen; lpter; Iq41; 5qter; 16qter; 16pter. Множинна гібридизація підтверджує дані про те, що термінальні області різних хромосом мають схожою структурою і багаті консервативними повторами. Отже, в клонотекі хромосоми 7р, розміром 12 млн.п.н, вдалося клонувати термінальну послідовність цієї хромосоми. Успіх клонування кінцевий області з ARS-послідовністю обумовлений, можливо, застосуванням TAR векторів, що не містять області почала реплікації.

...
ПОДІЛИТИСЯ:

Дивіться також:
Маловідомі ссавці Африки