Трансдукція гена

На першому етапі всі лінії клітин котрансфеціровали геном tat HIV-1, що знаходиться під контролем индуцируемого цинком металлотіонеінового промотора миші, і плазмідой, що містить ген ПЕО. Для аналізу ростових характеристик (проліферації і здатності утворювати фокуси) і морфології трансфекованих клітин використовували одержувані в результаті трансфекції поліклональні культури клітин, резистентних до антибіотика G-418.

Як клітини Rat-2, так і клітини PC 12, трансфекованих геном tat, характеризувалися істотно більш високою проліферативною активністю в порівнянні з контрольними клітинами. В обох випадках цей ефект посилювався при додаванні в середу індуктора – ZnSO4. Ці результати відповідають даним, отриманим раніше на хондроцитах людини і клітинах PC 12, які вказували на підвищення продуктивності лікарських гена tat HIV-1 на проліферацію цих клітин. В експериментах, проведених на клітинах PC 12, було виявлено вплив білка Tat на передачу сигналів в цих клітинах, зокрема, за рахунок посилення фосфорилювання фактора pl25FAK і його асоціації з фосфоінозитидів-3-кінази. Можливо, цим впливом почасти й обумовлено спостерігається в наших та інших експериментах посилення проліферації PC 12 клітин під дією гена tat. Слід зазначити, що поряд з цим в літературі є дані про інгібірує, білка Tat на проліферацію лімфоцитів (Patki, Lederman, 1996). Зокрема, в первинних нейронах людини білок Tat викликав апоптоз через залучення в цей процес окисного стресу. Таким чином, наявні в даний час факти підкреслюють поліфункціональність продукту гена tat і дозволяють зробити висновок, що ефекти цього гена можуть істотно відрізнятися в різних типах клітин.

Наші експерименти з tatf-трансфекованих Rat-2 клітинами показали, що такі генетично модифіковані клітини здатні утворювати багатошарові колонії. Однак морфологія іншого виду клітин – культури клітин PC 12 – залишалася незмінною під дію гена tat. He було виявлено також впливу фактора росту нервів на нейрональную диференціювання клітин PC 12, трансфекованих геном tat.

Трансфекція геном tat ембріональних фібробластів миші показала, що цей ген індукує у них формування фокусів трансформації. Крім того, котранфекція генами tat і c-Ha-rasl збільшувала ефективність освіти фокусів. Це збільшення було статистично значущим як і при котранфекціі цих клітин двома добре відомими онкогенами c-Harasl і з-тус. Число багатошарових колоній помітно зростала і після котранфекціі клітин генами tat і з-тус. Отримані результати підтверджують дані про наявність у гена tat онкогенного потенціалу і свідчать про наявність кооперації між продуктом гена tat HIV-1 і класичними клітинними онкогенами c-Ha-rasl і з-тус. На підставі цих даних був зроблений висновок, про те що, по крайней мере, деякі ефекти гена tat на клітини є клітинно-специфічними, на окремі типи клітин він надає онкогенное дію.

На наступному етапі ми проводили котрансфекцію цих же трьох ліній клітин щура плазмидами, що містять ген з ВІЛ-1, що знаходиться під контролем промотра цитомегаловірусу. Як негативний контролю використовували плазміду з геном nef містить мутацію, що приводить до зрушення рамки трансляції. В результаті було показано, що під дією гена nef відбувається зменшення швидкості проліферації клітин Rat-2 і PC 12, що протилежно ефекту, що чиниться геном tat. Отримані нами результати корелюють з даними, що свідчать про те, що продукт гена nef здатний зменшувати проліферативний відповідь на дію тромбоцитарного фактора росту, знижує проліферативну активність лімфоцитів за рахунок зменшення кількості рецепторів інтерлейкіну-2 на клітинної поверхні. Поряд з цим є дані, що вказують на здатність екзогенного білка Nef стимулювати проліферацію нормальних мононуклеарних клітин периферичної крові людини.

...
ПОДІЛИТИСЯ:

Дивіться також:
Вірус краснухи – реферат