Структурні перебудови

Успіх застосування YAC для будь-яких молекулярно-генетичних завдань залежить від його структурної і мітотичної стабільності. Безліч елементів, що повторюються в ДНК вищих еукаріот індукує процеси гомологичной рекомбінації в ДНК YAC, приводячи до внутрішньо-і міжмолекулярним перебудовам клонованого фрагмента.

Перебудови структури клонованого фрагмента ДНК YAC: делеции, инсерции, обміни – були кількісно оцінені нами в дослідах з “маркованими” YAC. Методом ретрансформація в клоновану ДНК понад двісті YAC була вбудована касета Alu-HIS3-Alu. Аналіз маркованих фенотипом 1-Ц8-ретрансформантов показав, що в процесі ретрансформація і наступних мітозів клітини відбувається ряд генетичних ефектів.
1. Інтеграція касети Alu-HIS3-Alu відбувається не тільки за рахунок го Мологе Alu повторів в ДНК людини, але і внаслідок гомології гена HIS3 дріжджів в складі касети. Методом гібридизації ДНК Alu зонда з ДНК хромосом кожного з 60 випадково відібраних His + ретрансформантов виявлено, що у 6 з них HIS3 маркер локалізується не в УАС-послідовності. Два акта інтеграції відбулися в хромосому 15, де розташований HIS3 ген, інші чотири в хромосоми 2, 4, 11, і 14 дріжджів.
2. Вибірка з 121 маркованого YAC була використана для визначення частоти делеций в УАС-последователиюсті при реплікації і підтримці його в дріжджах. Контролем служили Руасі-вектори, що не містять ДНК людини. Аналіз не менше 50 субклонов кожного ретрансформанта (всього 6561) після 20-30 генерацій виявив, що 239 субклонов, несучих YAC (4,5%), втратили HIS3 маркер. У контролі ця величина дорівнює 0,06%. Таким чином, частота делеций касети Alu-HIS3-Alu в YAC з ДНК людини підвищується на два порядки.
3. Нам вдалося також кількісно оцінити частоту обмінів між ДНК YAC і природних хромосом дріжджів: 5% ретрансформантов, ранку тівшіх YAC під час інкубації, зберігають Н18 + -фенотіп. Генетичний аналіз показав, що послідовність HIS3 виявляється як в районі локусу цього гена, так і в локусах інших хромосом. Частота рекомбінаційних подій становить 102.

При визначенні розмірів YAC всій клонотекі було виявлено, що частина первинних трансформантов містить не один, а кілька YAC (2-4), що відрізняються за молекулярною масою. Цей факт відзначений в публікаціях та інших авторів, які вважали його наслідком проникнення в клітину при трансформації кількох рекомбінантних структур одночасно. Однак виявлена й інша причина: кілька YAC в одній клітці можуть з’явитися результатом структурної перебудови одного і того ж УАС-клону. Прослідкувала доля YAC в 6 лініях незалежних трансформантов. Генетичний аналіз диплоїдних гібридів цих ліній після п’ятикратного послідовного схрещування показав, що жоден з двох або більше YAC не втрачається при проходженні кліткою мітозу і мейозу.

Всі три генетичних маркера YAC виявляють косегрегацію і спадкоємство Менделя, тобто проявляють властивості одиночній автономно-реплицирующейся структури. Той же висновок випливає з результатів рестрікт-ного аналізу і дослідів по ДНК-ДНК-гібридизації в клітинах постмейотіческіх сегрегантов. Очевидно, в вивчених лініях має місце структурна нестабільність клонованого в YAC фрагмента ДНК, при якій тільки певні перебудови життєздатні і підтримуються кліткою. Ці результати кількісно підтверджують дані інших авторів про акти рекомбінації, як джерелі химерних YAC.

Таким чином, поєднання методів молекулярної біології і класичної генетики при аналізі УАС-клонотекі, що містять ДНК з різних джерел, дало можливість кількісно оцінити ймовірність порушення автентичності клонованої ДНК.

...
ПОДІЛИТИСЯ:

Дивіться також:
Методи селекції