Роль штучних хромосом дріжджів у вивченні геному людини

Прочитання генетичного коду геному людини стало центральною проблемою молекулярної біології і генетики в кінці 80-х років. Національні програми “Геном людини” були прийняті в усіх країнах з розвиненою наукою, в тому числі і в колишньому Радянському Союзі. У підсумку за 10 років інтенсивної роботи світової спільноти на межі третього тисячоліття начорно розшифрована нуклеотидная послідовність генома людини, створені фізичні карти кожної з 23 хромосом, ідентифіковані гени, відповідальні за багато спадкових захворювань.

Повністю завершено секвенування більше десятка геномів мікроорганізмів, рослин, нижчих і вищих еукаріот. Виникли нові науки – геноміка і протеома-ка. Успіхи в цих областях багато в чому обумовлені можливістю клонувати ДНК в штучних хромосомах дріжджів (YAC).

Лабораторія молекулярної генетики дріжджів ІМГ РАН – єдиний вітчизняний науковий колектив, який освоїв і застосовує прецизионную і трудомістку техніку конструювання УАС-клонотекі з подальшим скринінгом УАС-клонів, їх аналізом і характеристикою, а також визначення генетичного контролю підтримки YAC в клітинах дріжджів.

В рамках всесоюзної, а пізніше всеросійської програми “Геном людини” нами були отримані і охарактеризовані в 1991-х роках УАС-клон-теки ДНК дрозофіли і лімфоцитів людини для пошуку протягом не-сателітних повторюванихпослідовностей РДНК генів.
Часткова бібліотека генома D. melanogaster містила УАС-клони, розмір яких від 90 до 500 т. П. Н. визначений при порівнянні їх з молекулярної масою природних хромосом, фракціоніруемих методом електрофорезу в пульсуючому полі, з подальшою візуалізацією забарвленням бромистим етидієм і ДНК-ДНК-гібридизацією. У співавторстві з співробітниками лабораторії чл.-кор. РАН В. А. Гвоздьова УАС-клони були генетично картіровани методом гібридизації in situ з політеннимі хромосомами слинних залоз личинок дрозофіли. Крім клонів, які локалізуються тільки в єдиному сайті еухроматину, отримані клони з повторюваними послідовностями з районів пріцентромерних бета-гетерохроматину.

Аналіз первинної структури одного з УАС-клонів з гетерохроматічной ДНК Х-хромосоми дрозофіли виявив дві послідовності, які представили інтерес для подальших досліджень. Одна з них – тандем залучених до процесу сперматогенезу генів Stellate, структура і функції яких в той час були мало вивчені, а інша – послідовність псевдогена 18S рРНК поза відомого раніше кластера 18S рДНК. Всупереч загальноприйнятій думці про те, що копії повторів, що кодують 18S рРНК, ідентичні, були отримані результати про існування в геномі варіантів 18S рДНК генів і про можливості рекомбінації між ними. Цей факт свідчить про внутрішньогеномних дивергенції і еволюції послідовностей РДНК. Таким чином, результати молекулярного аналізу гетерохроматичному районів, які включають втратили свої функції елементи – псевдогени, можуть прояснити окремі етапи еволюції геному.

Клонування ДНК лімфоцитів людини було зроблено теж для пошуку повторюваних послідовностей РДНК. До початку роботи, проведеної в 1992-1993 рр. спільно з лабораторією академіка А. А. Баєва (ИМБ РАН), було відомо, що кластер генів 5S рРНК людини локалізована в хромосомі 1 і представлений двома типами коротких повторів 2,2 і 2,6 т.п.н., їх олигомерами з двох-чотирьох копій, а також протяжними ділянками (близько 100 т.п.н.) з послідовністю РДНК. Для більш детального вивчення організації та поліморфізму кластера генів 5S рРНК нами було проведено скринінг 903 УАС-трансформантов, в результаті якого були відібрані 12 клонів, що дали позитивний сигнал з зондом 5S рРНК. Субклонірованіе і рестріктний аналіз ДНК восьми з цих клонів показали, що вони містять кластер повторів з розміром повторюваного елемента 6 т.п.н., в якому є три рівних субелемента, що містять послідовність псевдогена 5S рРНК (400 п.н.). Проміжки між субелементамі розрізняються за наявністю сайтів рестрикції. Ці дані підтвердили припущення про гетерогенності організації кластерів повторюваних генів РДНК у людини. Поліморфізм може бути фактором, модулирующим експресію генів в складі кластера.

...
ПОДІЛИТИСЯ:

Дивіться також:
Обмін речовин. Вітаміни