Промоторна активність в клітинах дріжджів послідовності HERV-K LTR клону YAC22-19

Відомі факти промоторної активності повнорозмірних одиночних LTR щодо інтактних генів, а також репортерних генів в складі рекомбінантних ДНК в некотороя тканеспеціфічних лініях клітин людини. Консервативність в еволюції послідовностей одиночних LTR передбачає і консервативність функцій.

Нами вперше показана активність LTR в клітинах нижчих еукаріот дріжджів – сахароміцетів. Для цього були сконструйовані реплікативні плазміди, до складу яких введена послідовність HERV-K LTR клону YAC22-19 в прямій і зворотній орієнтації по відношенню до репортерного гену ліхенази-L / cB Clostridium thermocellum. Цими плазмидами (LTRnp-LicB і LTRo6p-LicB) трансформували клітини дріжджів штаму YPH 857.

Ефективність роботи промотора HERV-K LTR в клітинах трансформантов визначали якісно і кількісно за активністю експрес-руемой ліхенази. Для якісного тесту колонії трьох незалежних і трьох контрольних трансформантов інкубували 3-12 і на середовищі, що містить ліхена. Ареол світіння навколо утворилися колоній вказує на експресію гена ліхенази, що знаходиться під контролем HERV-K LTR-промотора. Для кількісного виміру активності ліхенази готували клітинний лизат з 5 незалежних трансформантов для кожної з двох орієнтації HERV-K LTR-промотора. У лізаті вимірювали активність ліхенази і унормувати її на загальну кількість білка в клітині.

Очевидно, що послідовність HERV-K LTR-клона YAC 22-19 здатна ініціювати транскрипцію репортерного гена ліхенази в клітці дріжджів в якості єдиного промотора. Отже, промотор HERV-K LTR не є специфічним для клітин людини, а може функціонувати і в нижчих одноклітинних еукаріотах. HERV-K LTR ініціює транскрипцію в дріжджах, перебуваючи в прямій і зворотній орієнтації щодо гена репортера, тобто володіє двобічної промоторной активністю. Властивість двобічної було відзначено при вивченні промотора HERV-K LTR в клітинної лінії тератокарціноми людини.

Цю здатність HERV-K LTR зберігає і в дріжджових клітинах. Порівняння активності HERV-K LTR промотора і найбільш сильних промоторів генів дріжджів Gal і TDH в дослідах з репортерного геном показало, що активність промотора HERV-K LTR становить 6,8% активності індуцібельная Gal промотора і 0,26% активності конститутивного промотора гена TDH. Відносно слабка промоторних активність HERV-K LTR мала місце і в клітинах людини. Посилення промоторной активності HERV-K LTR в лінії клітин людини може відбуватися за рахунок енхансерних послідовностей, з якими зв’язуються білкові фактори транскрипції. Відносно дріжджів поки не відомо, чи є білки, здатні взаємодіяти з послідовністю LTR в ролі промотора.

...
ПОДІЛИТИСЯ: