Проект “Хромосома 19” і проблема химер

Проект “Хромосома 19” в рамках програми “Геном людини” припускав здійснити картування, секвенування та вивчення ролі функціонально-значущих некодуючих послідовностей. На додаток до космідной і до ДНК клонотеки хромосоми 19 була створена часткова клонотекі протяжних фрагментів ДНК в штучних хромосомах дріжджів.

Як джерело ДНК хромосоми 19 були використані дві лінії гібридних соматичних клітин (гризун-людина) GL12-42 (ІБХ РАН) і UU5HL-58 (LLNL, США), що містять в якості людського компонента тільки хромосому-19.
Скринінг клонотекі (понад дві тисячі трансформантов) за допомогою ін-тегратівной селекції і методом гібридизації колоній in situ з зондами повторюваних елементів ДНК людини показав, що УАС-клони з ДНК людини становлять близько 1%.
Клони з фрагментами ДНК хромосоми 19 людини, використані в нашій роботі, були передані для фізичного картування і депонування в банк даних в Національну лабораторію Лівермора (США), з якою співпрацював російський колектив проекту “Хромосома 19”.
проблема химер
Колекція декількох тисяч YAC-клонів, що містять фрагменти ДНК дрозофіли, лімфоцитів і хромосоми 19 людини, надала чудову можливість використовувати YAC як модельної системи для дослідження структурної та митотической стабільності штучної хромосоми.
При аналізі бібліотек тотальної ДНК генома і хромосом-специфічних клонотекі ДНК людини, створених на початку 90-х років, виявлено від 20 до 50% химерних клонів, які вносять артефакти в дослідження нуклеотидної послідовності генома і при зіставленні фізичних і генетичних карт хромосом.

Механічні розломи, одно- і двунітевие розриви ДНК, а також лігування плечей вектора більш ніж з одним фрагментом ДНК рестріктов з різних областей хромосоми можуть призводити до утворення химерних YAC, якими трансформують сферопласти дріжджів. Для зниження ймовірності таких подій in vitro процедури з клонованої ДНК проводили в легкоплавку агарозе, іммобілізуя молекули ДНК. Частка химер зменшується і при зниженні концентрації клонують ДНК людини в ЛІГІР суміші. Подібний ефект “розведення” має місце при створенні УАС-клонотекі з клітин соматичних гібридів, де частка ДНК людини становить близько 1%. У таких УАС-клонотекі частка химер не перевищує 10%.
В останні роки була запропонована нова технологія отримання клонів в складі YAC – метод трансформаційно-асоційованої рекомбінації. Метод виключає лігування YAC in vitro і знижує тим самим ймовірність утворення химер. Детально метод описаний нижче.

In vivo нестабільність структури YAC виникає в процесі мітотичного поділу дріжджів при рекомбінації повторів в ДНК YAC або гомологічних сайтів клонованої і природного ДНК дріжджів. Частота всіх типів перебудов в ДНК YAC знижується в 5-8 разів при використанні в якості реципієнтів дріжджів з мутаціями в генах, що контролюють репарацію / рекомбінацію.

...
ПОДІЛИТИСЯ:

Дивіться також:
Стани неживих тіл