Основні методи лабораторного виявлення бактерій

Зміст

  • Де і навіщо шукати?
  • Устаткування мікробіологічної лабораторії
  • Методи виявлення деяких бактерій
  • Listeria monocytogenes – збудник бактеріальної інфекції істеріозу
  • Виявлення окремих клітинних структур
  • Виявлення капсул
  • Забарвлення суперечка
  • Виявлення клітинної стінки
  • Роль цитоплазматичної мембрани та її утворень

Метод вивчення – певна сукупність дій, яка дозволяє досліднику досягти мети дослідження. Основою для бактеріологічних досліджень є методи загальної мікробіології. Саме на них заснований метод виявлення бактерій роду Salmonella та інших небезпечних для людини мікробів, а також виявлення прокариотов в навколишньому середовищі для інших утилітарних цілей.

Де і навіщо шукати?
Перевіряти їжу людини на вміст у ній різних видів мікроорганізмів – загальновідома задача мікробіологічних досліджень на виявлення штамів бактерій з різним ступенем вірулентності.

Проте зважаючи стрімкого розвитку біотехнологій, необхідність виявляти певні види мікроорганізмів може виникати в самих різних галузях життєдіяльності людини:

медицина і ветеринарія;
фармацевтика;
харчова промисловість;
сільське господарство та переробка сільськогосподарських продуктів;
хімічна промисловість.
Крім того, виявлення прокариотов з метою їх вивчення – одна з найактуальніших завдань мікробіологів, які сьогодні тільки починають знайомитися з величезною різноманітністю представників без’ядерної органіки.

При роботі з тим чи іншим біологічним матеріалом в мікробіологічних лабораторіях використовуються кілька основних методів:

мікроскопія (світлова, електронна);
біологічні методи (культивування та ідентифікація організмів);
молекулярно-генетичний метод;
серологічний (виявлення антигенів).
Ці основні методи дозволяють не тільки виявити не видимі неозброєним оком бактеріальні клітини, а й вивчити їх структурні елементи і фази життєдіяльності.

razmnojenie bacteriy

Дані про структуру та життєвих процесах досліджуваних бактерій дозволяють ідентифікувати виділений біологічний матеріал і співвіднести його з тими видами прокариотов, які вже описані в мікробіологічної літературі або ж зареєструвати відкриття нових видів без’ядерних організмів.

Устаткування мікробіологічної лабораторії
Можливість застосовувати методи виявлення клітин бактерій може бути присутнім тільки в рамках організації бактеріологічної лабораторії. Це спеціально обладнані комплекси, які функціонують:

при поліклініках і диспансерах;
при санітарно-епідеміологічних станціях або їх підрозділах;
при науково-дослідних центрах;
при підприємствах по випуску біопрепаратів.
Практично всі перераховані лабораторії працюють з прокариотами низькою і середнього ступеня вірулентності (небезпеки для людини). Небезпечні бактерії можна досліджувати тільки в спеціалізованих лабораторіях.

Основу лабораторії складають:

термостат для регулювання і підтримки стабільних температурних режимів;
мікроанаеростат для підтримки анаеробної середовища;
холодильник для зберігання середовищ, проб і мікроорганізмів;
центрифуги для осадження досліджуваного матеріалу зі стінок пробірок;
піч Пастера для повітряної стерилізації лабораторних приладів;
автоклав для стерилізації під тиском.
Бактеріологічна лабораторія

Крім перерахованих апаратів, лабораторія також оснащена мікроскопами, планшетами, дозуючими приладами, наконечниками і бактеріологічними аналізаторами в залежності від специфіки лабораторії.

Методи виявлення деяких бактерій
Сальмонела – патогенний бактеріологічний агент, який може інфікувати людину через їжу. Для своєчасного ізолювання заражених продуктів та їх утилізації розроблений і затверджений ГОСТом в 1998 році метод виявлення бактерій роду Salmonella в харчових продуктах.

Суть методу полягає в наступному:

Пробу продукту висівають на неселективним ПС (поживний бульйон, на якому може рости більшість мікроорганізмів).
Посів витримується при стабільній температурі (инкубирование).
Проводять підбір селективної середовища (тієї, на якій ростуть тільки сальмонели).
Виконують пересадку вирослих бактеріальних колоній на селективну для сальмонел середу.
Реєструють результати.
Salmonella
Бактерія Сальмонела (Salmonella)

Методологія визначає всі нюанси проведення дослідження: від кількості проб до складу поживних середовищ і посуду, що може використовуватися працівниками лабораторії для отримання достовірних результатів їх роботи.

Listeria monocytogenes – збудник бактеріальної інфекції лістеріозу
При ураженні людського організму Listeria monocytogenes стають внутрішньоклітинними паразитами (бактеріальні клітини проникають всередину еукаріотичних). Через деякий час їх виявляють у клітинах практично всіх внутрішніх органів людини, оскільки ці бактерії поширюються через кров.

З цієї причини симптоми бактеріального зараження можуть проявлятися в різній формі: ангіна, менінгіт, кон’юнктивіт і т.д., будь-які форми сепсису (зараження внутрішніх органів).

Для запобігання цій бактеріальної загрози розроблені та затверджені методи виявлення Listeria monocytogenes у харчових продуктах.

Для цілей виявлення Listeria monocytogenes нормативні акти визначають їх як грампозитивні неспорообразующие бактеріальні палички, які ростуть на щільних селективних середовищах. Форми їх колоній – короткі ланцюжки, іноді довгі нитки.

Лістерія (Listeria monocytogenes)
Listeria monocytogenes

Технологія методу:

Для дослідження відбирається проба, яка розсіюється на живильному середовищі, що підходить для великої кількості мікроорганізмів, і інкубується протягом доби при температурі 30 ° С.
У зв’язку з тим, що найчастіше Listeria monocytogenes знаходиться в продукті в невеликій кількості, на наступному етапі їх виявлення наявну середу збагачують спеціально підібраними для Listeria monocytogenes поживними елементами (роблять живильне середовище більш селективної) і витримують протягом 2-х діб при температурі 37 ° С.
Отримані колонії пересівають на дві живильні середовища: по Оттавіані і Агосто (ALOA) і одну з трьох (Оксфорд агар, палиці агар, ПАЛ – поживний агар для виділення лістерій). Перший посів інкубують добу при температурі 37 ° С, після чого реєструють наявність або відсутність колоній, характерних для Listeria monocytogenes. Другий посів витримують трохи довше (на 3:00) і також реєструють можливі прояви колоній Listeria monocytogenes.
Можливі прояви наявності бактеріальних колоній Listeria monocytogenes виглядають наступним чином:

Колонії клітин мають синьо-зелене забарвлення. Крім того, навколо колонії спостерігається непрозорий ореол.
Пошкоджені бактеріальні клітини не дають характерного ореолу або він тільки ледь помітний.
На ПАЛ-агарі колонії мають сіро-зелений або оливково-зелений колір. Їх оточує ореол чорного кольору. Іноді колонія має чорний центр.
Після виявлення колоній Listeria monocytogenes їх починають вивчати більш докладно:

виробляють реакцію на каталазу;
фарбують за Грамом;
визначають рухливість;
перевіряють на бета-гемолітичну активність тощо
Колонії Listeria monocytogenes

Також сьогодні в лабораторіях є матеріал для проведення експрес-аналізів по спеціалізованим таблицями, які виготовляються під кожен вид продуктів або іншого досліджуваного матеріалу. Їх можна придбати в спеціалізованих магазинах, як і інше лабораторне обладнання.

Виявлення окремих клітинних структур
Виявлення джгутиків дозволяє ідентифікувати бактеріальні клітини за типом рухливості.

Виявити клітинну структуру не так просто, як знайти саму бактерію. Для цих цілей використовуються різні способи забарвлення джгутиків.

Спосіб забарвлення джгутиків полягає в тому, що різні за складом барвники осідають на їх поверхні. У результаті такого осідання джгутики товщають. Крім того, зменшується прозорість як всієї клітини, так і самого джгутика (бактеріальна клітина в звичайних умовах практично прозора).

Метод забарвлення джгутиків за Цілем передбачає таку технологію виконання:

Краплю водного розчину з чистою культурою наносять на предметне скло і висушують в природних умовах.
Бактерій протруюють спеціальним розчином на основі спирту, сірчанокислого заліза і таніну, оскільки поки бактерії живі, забарвити їх джгутики неможливо.
Після цього їх профарбовують карболовим фуксином Циля.
Предметне скло промивають водою і просушують.
З чого складаються джгутики

Після всіх проведених процедур джгутики будуть видно в мікроскоп як тоненькі ниточки.

Виявлення капсул
Капсула також є клітинною структурою, яка властива не всім бактеріям і по якій прокаріоти можна ідентифікувати.

Методи виявлення капсул також засновані на фарбуванні органічними аніліновими барвниками.

Забарвлення капсули за Романовським-Гімзою відбувається за такою технологією:

На предметне скло наноситься мазок розведеною чистою культури.
Скло встановлюється мазком вниз в чашку Петрі на скляні підставки.
У чашку Петрі додають 20 крапель фарби Романовського-Гімза.
Через 15-20 хвилин предметне скло промивають і висушують.
У результаті бактерії забарвлюються в темно-синій колір, а капсули набувають рожеве забарвлення.
Забарвлення по Міхіну – виявлення капсул за допомогою метиленової сині Леффера. При цій забарвленням капсули також набувають рожевий колір, а бактерії – синій.

Особливості забарвлення капсул пов’язані з їх складом. Капсула складається з полісахаридів або поліпептидів (капсула сибірської виразки), які швидко вступають в реакцію з тими барвниками, які використовуються в лабораторіях.

Забарвлення суперечка
Певні складнощі пов’язані з виявленням таких кислотостійких структур бактерій, як суперечки.

Суперечки не фарбуються тими простими барвниками, які використовуються для більш сприйнятливих клітинних структур. При використанні цих способів суперечки залишаються безбарвними.
Схема спороутворення бактерій

Однак виявлення суперечка є важливим моментом, оскільки спороносні бактерії найчастіше мають високу патогенністю. Крім того, зважаючи підвищеної кислотоустойчивости, тепло- і светоустойчивость, суперечки дуже складно ліквідувати.

Для виявлення суперечка були розроблені спеціальні протрави, які розпушують кислотоустойчивую оболонку, що дозволяє барвнику проникнути всередину.

Фарбування суперечка за методом Меллера:

мазок поміщають на дві хвилини в хлороформ;
обробляють 5% водним розчином хромової кислоти;
промивають у воді і забарвлюють карболовим фуксином.
суперечки забарвлюються в червоний колір.
Є ще кілька методів виявлення таких клітинних структур, як суперечки, і всі вони припускають первісне вплив на стійку стінку суперечки.

Виявлення клітинної стінки
Клітинна стінка бактерії – унікальна структура. Тільки у прокаріотів є клітинні стінки, і саме завдяки цим стінок можна виробляти первинну ідентифікацію без’ядерних організмів.

Стінка прокариотической клітини складається з білка муреіна. Виходячи з того, що стінки бувають одношарові і багатошарові, датська лікар Грам запропонував спосіб виявлення сильних патогенів з фарбування їх стінки. Спосіб припускає, що багатошарові стінки не відреагують на фарбування і залишаться безбарвними (грамнегативні), а одношарові стінки придбають синє забарвлення.

Будова клітинної стінки грампозитивних і грамнегативних бактерій

Роль цитоплазматичної мембрани та її утворень
Цитоплазматична мембрана – важлива частина клітини, що забезпечує зв’язок між цитоплазмою і клітинною стінкою.

Виявити цитоплазматичну мембрану фарбуванням не представляється можливим. Крім того, в цьому немає ніякої практичної необхідності, оскільки цитоплазматическая мембрана – обов’язкова структура кожної бактеріальної клітини.

Цитоплазматична мембрана має практично завжди один і той же біохімічний склад. Для вивчення структур клітини та її включень необхідно вивчення проводять функцій цитоплазматичної мембрани. Ці дослідження здійснюються такими бактеріологічними методами, як молекулярно-генетичний і серологічний.

Посилання на основну публікацію