Клонування в YAC методом трансформаційно-асоційованої рекомбінації

В рамках проекту “Хромосома 19” в лабораторії, керованої академіком Є. Д. Свердлов (ІБХ РАН), детально вивчені послідовності довгих кінцевих повторів ендогенних ретровірусів людини сімейства К (LTR HERV-K) хромосом 19,21 і 22 людини, для яких визначені первинна структура цих елементів і фланкирующей їх геномної ДНК, локалізація на фізичній карті, систематика, еволюційний вік і передбачувані регуляторні функції.

Аналіз розподілу копій LTR по всьому геному свідчить про те, що деякі хромосоми, в тому числі 19-я, збагачені LTR, а інші містять помірну або мале число їх копій. Для визначення функціональної активності, специфічності розподілу і часу інтеграції в геном LTR HERV-K необхідний порівняльний аналіз цих послідовностей в різних хромосомах. У зв’язку з цим в якості ще одного об’єкта дослідження авторських колективів в РФ і ФРН (Філіпа Університет Марбурга) в 1997 році була обрана хромосома 7.

Для конструювання клонотекі нам була передана проф. К.-Х. Гржешіком (ФРН) лінія гібридних соматичних клітин RuRag 14-4-7-44, де хромосома 7 представлена малим плечем зі своєю теломер і інший теломер, близько зчепленої з центромерой, а геном миші – гетероплоідним набором хромосом, близьким до 4п. Менше 10% клітин лінії RuRag 14-4-7-44 після розмноження культури мають мале плече 7 хромосоми. Виходячи з розмірів генома миші і 7р хромосоми слід було очікувати, що не більше 1 з 2000 року отриманих УАС-трансформантов міститимуть ДНК людини при рутинному методі клонування.

З метою збереження автентичності ДНК людини в YAC і підвищення ефективності проведеної роботи нами був застосований альтернативний підхід клонування – метод трансформаційно-асоційованої рекомбінації. Штучна хромосома дріжджів з клонованою фрагментом гетерологичной ДНК “конструюється” in vivo за рахунок супутніх процесу котрансформаціі актів гомологичной рекомбінації між повторюваними елементами ДНК людини (наприклад Alu) і тими ж повторами, включеними до складу вектора. В результаті селективне клонування ДНК людини відбувається внутрішньоклітинно на стадії виникнення трансформантов. Перевагами методу є практично повна відсутність химерних фрагментів клонованої ДНК людини і багаторазове збагачення клонами ДНК людини при створенні бібліотеки з ДНК клітин монохромосомних соматичних гібридів гризун / людина.

У дослідах з клонування TAR-методом використані вектори, які утворюють в процесі трансформації лінійні і кільцеві YAC. Характерною особливістю TAR-векторів є відсутність ARS-послідовності, що забезпечує реплікацію YAC в дріжджах. Відомо, що в геномі людини ARS-подібні послідовності розташовані досить часто, в середньому 1 на 30-40 т.п.н. Отже, протяжні фрагменти ДНК людини, клоновані в YAC, можуть з великою ймовірністю містити ARS-структури, здатні реплицироваться в дріжджах. Використання векторів, позбавлених дріжджового ARS, забезпечує додатковий механізм селекції.

...
ПОДІЛИТИСЯ:

Дивіться також:
Клітинна інженерія