Клонування генів біосинтезу антибіотиків

Процес біосинтезу одного антибіотика може складатися з 10-30 ферментативних реакцій, так що клонування всіх генів його біосинтезу – завдання не з легких. Один з підходів до виділення повного набору таких генів заснований на трансформації одного або декількох мутантних штамів, не здатних синтезувати даний антибіотик, банком клонів, створеним з хромосомної ДНК штаму дикого типу. Після введення банку клонів в мутантні клітини проводять відбір трансформантов, здатних синтезувати антибіотик. Потім виділяють плазмидную ДНК клону, що містить функціональний експресується ген антибіотика [т. е. ген, який відновлює (комплементірующій) втрачену мутантним штамом функцію], і використовують її як зонд для скринінгу іншого банку клонів хромосомної ДНК штаму дикого типу, з якого відбирають клони, що містять нуклеотидні послідовності, які перекриваються з послідовністю зонда. Таким чином, ідентифікують, а потім клонують елементи ДНК, що примикають до комплементірующей послідовності, і відтворюють повний кластер генів біосинтезу антибіотика. Описана процедура відноситься до випадку, коли ці гени згруповані в одному сайті хромосомної ДНК. Якщо ж гени біосинтезу розкидані у вигляді невеликих кластерів по різних сайтах, то потрібно мати принаймні по одному мутанту на кластер, щоб отримати клони ДНК, за допомогою яких можна ідентифікувати інші гени кластерів.

Цей підхід з успіхом використовувався для ідентифікації деяких генів біосинтезу ундецілпродігіозіна з Streptomyces coelicolor A3. У цьому випадку комплементаціонний аналіз ґрунтується на порівнянні кольору колоній: колонії мікроорганізмів дикого типу мають червоний колір, а колонії мутантних мікроорганізмів – кремовий. Таким чином, в результаті комплементации утворюється червона колонія.

Крім комплементации, для ідентифікації генів біосинтезу антибіотиків можуть використовуватися і більш прямі підходи. Так, за допомогою генетичних або біохімічних експериментів можна ідентифікувати, а потім виділити один або кілька ключових ферментів біосинтезу, визначити їх N-кінцеві амінокислотні послідовності і, виходячи з цих даних, синтезувати олігонуклеотидних зонди. Цей підхід використовувався для виділення з Penicillium chrysogenum гена синтетази ізопеніцілліна N. Цей фермент каталізує окислительную конденсацію d- (La-аміноадіпіл) -L-цистеїн-D-валіну в ізопеніціллін N, ключове проміжна ланка в біосинтезі пеніцилінів, цефалоспоринів та цефаміцінов.

Посилання на основну публікацію