Ідентифікація гена SRM5 і SRM8

Генетичне картування показало, що мутація srm5 локалізується в безпосередній близькості від локусу CDC28 і, можливо, навіть всередині нього. Результати тестів на алелізм і на функціональну Комплементація мутації srm5 геном CDC28, клонованою в складі кільцевої плазміди, підтвердили, що srm5 є мутантом аллелем CDC28. Надалі мутація srm5 буде позначатися cdc28-srm. Секвенування показало, що мутація cdc28-srm повинна викликати в амінокислотноїпослідовності білка Cdc28p заміну G20S.

Для клонування гена SRM8 скористалися чутливістю клітин srm8 до підвищеної температури. Штам C3L (Мата srm8 Ieu2) трансформували ДНК геномної бібліотеки дріжджів 2J351; серед трансформованих клонів, які втратили температурочувствітельной, характерну для C3L, ідентифікували варіанти з морфологічно нормальними круглими клітинами (клітини C3L, як і клітини інших ліній srm8, сильно витягнуті). Один з ідентифікованих таким чином клонів, позначений C3L-2J-1, був підданий подальшому аналізу. З культури клітин C3L-2J-1 виділили плазмиду розміром близько 9 т.п.н., позначену 2J-1. Відповідно за вирахуванням довжини ДНК вектора YEp351, клонований фрагмент ДНК повинен мати розмір близько 3,5 т.п.н.

Плазмидой 2J-1 ретрансформіровалі клітини штаму C3L (srmS). Мітотична стабільність плазміди 2J-1 виявилася відносно високою (близько 80%) як у первинного трансформанта C3L-2J-1, так і у ретрансфор-мантів. Ми не мали вектором YEp351, вихідним для 2J-1, проте наявний в нашому розпорядженні вектор YEpl3, структурно схожий з YEp351, характеризується відносно високою мітотичної стабільністю в клітинах 71L (SRM +) і істотно менш стабільний в клітинах C3L (srm8).

Таким чином, мутація srm8 супроводжується зниженням мітотичної стабільності плазміди YEpl3. Цілком ймовірно, ген SRM8 бере участь в підтримці плазмід, що містять в своєму складі ori-послідовність з 2 плазміди, в тому числі і плазміди YEp351, вихідної для 2J-1. Відповідно мутація srm8 повинна викликати зниження мітотичної стабільності таких плазмід. Відносно висока мітотіче-ська стабільність плазміди 2J-1 в клітинах srm8 цілком ймовірно обумовлена присутністю в ній вставки розміром близько 3,5 т.п.н., яка імовірно комплементірует мутацію srm8. Іншими словами, розглянуті дані вказують на можливість наявності в складі 2J-1 клонованої послідовності гена SRM8.

На підтвердження висловленого припущення трансформанти C3LD (srm8 / srm8), які отримали плазмиду 2J-1, а) менш чутливі до у-опромінення, ніж трансформанти того ж реципієнта, що несуть плазміду YEpl3 (схожу з вихідним вектором для 2J-1) і б) здатні спорулі-ровать, на відміну від реципієнтних клітин або трансформантов з YEpl3 (дані не наведено).

Таким чином, присутність в мутантних клітинах плазміди 2J-1 супроводжується усуненням морфологічних змін клітин, а також відновленням у гомозиготних диплоидов нормальної радиорезистентности і здатності споруліровать. Крім того, фрагмент ДНК, клонований в 2J-1, мабуть, забезпечує відносно високу (порівняно з YEpl3) митотическую стабільність цієї плазміди в мутантних клітинах, кількісно відповідну митотической стабільності YEpl3 в клітинах 71L (SRM +). Перераховані властивості 2J-1 дозволяють констатувати функціональну Комплементація мутації srm8 фрагментом ДНК, клонованою в цій плазмиде. Мітотична стабільність плазміди 2J-1 у трансформантов 71L (SRM +) несподівано виявилася низькою. Природа цього ефекту потребує спеціальному дослідженні. Можливо, він викликаний присутністю в клітинах множинних копій послідовності SRM8.

Встановлено нуклеотидні послідовності довжиною 760 п.н. з обох кінців клонованого фрагмента. Аналіз нуклеотидної послідовності з використанням баз даних SGD (BLAST) виявив присутність в клонованої послідовності фрагментів двох дивергентно транскрібіруемих рамок зчитування, локалізованих на хромосомі X (як і слід було очікувати на підставі результатів генетичного картування) і віддалених один від одного на відстань менше 200 п.н . (Рис. 31). Одна з цих рамок, YJL076w, має довжину 3566 н., Інша, YJL077C, – 392 н. Клонована нами послідовність ДНК містить фрагмент YJL076w, що кодує 80% послідовності відповідного білка, починаючи з N-кінця, і 38% послідовності YJL077c (вся послідовність YJL077c в 9 разів коротше послідовності YJL076w).

За допомогою П1ДР описаний вище клонований фрагмент рамки YJL076w добудований до її повнорозмірною величини згідно з даними банку нуклеотиднихпослідовностей S. cerevisiae. Потім отриману конструкцію використовували для інактивації (disruption) відповідного хромосомного гена. Нульовий мутант по рамці YJL076w фенотипически не відрізнявся від мутантів srm8 і виявився аллель цим мутантів: схрещуючись з ними, він давав діплоїден, що характеризувалися, як і діплоїден srm8lsrm8, істотно зниженою швидкістю поділу, специфічними морфологічними змінами клітин, втратою здатності споруліровать. Таким чином, гену SRM8 відповідає відкрита рамка зчитування YJL076w.

Як випливає з публікацій останніх років, гену SRM8 ідентичний ген CFI1 / NET1, який опосередковує проходження клітинного циклу, будучи негативним регулятором виходу з мітозу. Клітини з інактивованих геном NET1 життєздатні, але мають аномально витягнуту форму, часто утворюють ланцюжки і розмножуються повільно як на зброжує, так і на несбражіваемих субстраті подібно описаним нами клітинам srm8. Крім змін регуляції клітинного циклу, у клітин netl виявлені мітохондріальні аномалії. Так, у мутанта з інактивованих геном NET1 виявляється зниження мітохондріального мембранного потенціалу.

...
ПОДІЛИТИСЯ: