Гібридні моноклональні антитіла людини і миші

Той факт, що різні ділянки молекули імуноглобуліну виконують різні функції, дозволяє модифікувати моноклональних антитіл миші таким чином, що воно набуває деякі сегменти антитіла людини, зберігаючи в той же час свою вихідну антігенсвязиваюшую специфічність. Таке гібридне антитіло називають химерним. Першим ділянкою моноклонального антитіла миші, який був замінений відповідною ділянкою антитіла людини, був Fc-фрагмент. Вибір пояснювався тим, що Fc-фрагмент антитіла миші виконував роль ефектора імунної відповіді у людини недостатньо добре; крім того, він з великою ймовірністю індукував утворення антитіл в організмі людини. Щоб знизити імуногенність та посилити ефекторні функції, провели заміну послідовностей ДНК, що кодують Fv-області L – і Н-ланцюгів імуноглобуліну людини, на аналогічні фрагменти специфічного моноклонального антитіла миші. Таку заміну можна здійснити різними шляхами: реплицировать ДНК in vitro із застосуванням олігонуклеотидів в якості затравки або використовувати субклонірованние фрагменти ДНК. Сегменти ДНК, що кодують химерні ланцюга, вбудовували в експресуючий вектор і вводили в культуру В-лімфоцитів, з якої виділяли напрацьовані антитіла.

Химерні антитіла, що несуть антигензв’язуючих ділянку моноклонального антитіла миші до поверхневого антигену клітин раку товстої кишки людини, тестували на хворих з раком товстої і прямої кишки. Антитіла залишалися в кровотоці приблизно в шість разів довше звичайних антитіл миші, тим самим надаючи свою дію протягом більшого часу. При цьому лише у одного пацієнта з 10 спостерігався слабко виражений імунну відповідь. На жаль, в цих випробуваннях не вдалося отримати протипухлинного ефекту антитіл: можливо, це було пов’язано з введенням їх в занадто малих дозах або з тим, що раковий процес знаходився на пізніх стадіях. У дослідах in vitro химерні антитіла виявляли високу ефекторну активність, що дозволяє сподіватися на успішне їх застосування в інших випадках.

Конструювання химерних молекул, про які йшла мова вище, – це перший етап у поєднанні моноклональних антитіл мишей і щурів, що володіють схожістю з антитілами людини. Інший підхід полягає в заміщенні тільки CDR-ділянок людських антитіл фрагментами моноклональних антитіл гризунів. Такі «восстановившие форму» антитіла людини можуть стати ефективним терапевтичним засобом, оскільки вони за своєю антигензв’язуючих здатності наближені до вихідних моноклональних антитіл гризунів.

Моноклональні антитіла гризунів, подібні з антитілами людини, можна отримати, виділивши кДНК L – і Н-ланцюгів з клітинної лінії гібридоми гризунів і ампліфікувати їх варіабельні області за допомогою ПЛР. В якості праймерів для ампліфікації можна використовувати олігонуклеотиди, комплементарні висококонсерватівним сегментам ДНК, фланкирующим з 5’і 3′-решт послідовність, що кодує варіабельний область. Знаючи нуклеотидні послідовності кДНК варіабельних областей легкої та важкої ланцюгів (VL і vh), легко визначити межі CDR, грунтуючись на тому, що відповідні їм послідовності гіперваріабельні, в той час як каркасні області щодо консервативні. Виходячи з даних про нуклеотидних послідовності ДНК, що кодують CDR гризунів, синтезували шість пар олігонуклеотидних праймерів. Кожна пара ініціювала синтез ДНК, що кодує одну з шести CDR гризунів: три, локалізованих на L-ланцюга, і три – на Н-ланцюга. Крім того, на 5′-кінці кожного праймеpa знаходилося 12 додаткових нуклеотидів, комплементарних фланкирующим послідовностям каркасних ділянок ДНК людини, за якими відбувалося вбудовування CDR-ДНК гризунів. Далі за допомогою олигонуклеотид-спрямованого мутагенезу здійснювали послідовну заміну CDR-ДНК людини ампліфікованої CDR-ДНК гризунів – фактичну «пересадку» CDR від гризунів в каркасні ділянки молекули антитіла людини. Модифіковану таким чином кДНК антитіл вбудовували в вектори експресії і трансформували ними відповідні клітини-господарі, зазвичай Е. coll або клітини ссавців, у яких і вироблялися антитіла.

Даний метод передбачає, що за антиген-зв’язує здатність антитіла відповідають тільки CDR-ділянки, а не каркасні області. Однак, якщо зв’язування «гібридного» антитіла з антигеном відбувається недостатньо ефективно, може виникнути необхідність у заміні деяких амінокислот в каркасних областях за допомогою олигонуклеотид-спрямованого мутагенезу.

До теперішнього часу цим методом отримано понад 50 різних моноклональних антитіл, що володіють схожістю з антитілами людини. На жаль, дана технологія, будучи досить ефективною і універсальною, досить дорога і вимагає великих витрат часу. Можливо, більш кращим способом отримання антитіл людини та їх фрагментів виявиться метод, заснований на використанні фагових «комбінаторних» бібліотек, створених на основі мРНК, отриманої з В-клітин неімунізованих донорів.

Посилання на основну публікацію