Електронна мікроскопія

У другій половині XX в. став активно використовуватися новий метод мікроскопування, що дає в 100 разів більший дозвіл біологічних об’єктів порівняно зі світловою мікроскопією, – електронна мікроскопія.
В електронному мікроскопі зображення будується за допомогою вузького пучка електронів, з високою швидкістю проходить через зріз тканини і взаємодіє з ним. Електрони можуть поглинатися зрізом або відхилятися від початкового напрямку, в результаті чого вузький пучок електронів буде розсіюватися. Як пристрої, що формують і фокусирующих потік електронів до взаємодії зі зрізом тканини і після цього, використовуються потужні кільцеві електромагніти. Напруга в колоні електронного мікроскопа досягає 100 000 вольт. Зображення будується на люмінесцентному екрані, який дає свічення при взаємодії з електронами. Замість відображення об’єкта на світному екрані його зображення можна зафіксувати на фотопластинці, що дає можливість отримати фотознімок. Для вивчення біологічних об’єктів довелося розробляти нові методи приготування препаратів.
Фіксують тканини для електронної мікроскопії глутаровий альдегідом, який «зшиває» білкові молекули, і дофіксіруют Тетраоксид осмію, який стабілізує двуслойние ліпідні мембрани і додатково фіксує тканинні білки. Для отримання зрізів зразки тканини просочують полімерними смолами, які тверднуть, утворюючи твердий пластмасовий блок. З нього на спеціальному приладі ультрамікротоме скляними або алмазними ножами роблять дуже тонкі зрізи товщиною 50-100 нм; з однієї клітини можна приготувати 100-200 зрізів. Потім зрізи просочують солями важких металів (урану, свинцю, фосфорно-вольфрамової кислоти) для збільшення контрастності зображення. Готові зрізи поміщають на тонку мідну сіточку, осередки якої покриті прозорою полімерною плівкою, і переглядають в електронному мікроскопі.
Крім зрізів, під електронним мікроскопом вивчають великі біологічні молекули, структуру мембран, білкові глобули, поверхня клітинних органоїдів. При вивченні поверхні органоїдів або молекулярних комплексів домагаються контрастного зображення різними прийомами. Зазвичай вона досягається за рахунок напилення під кутом до поверхні об’єкту тонкого шару золота або платини. Товщина шару золота на поверхні відповідає структурним особливостям об’єкта. Деякі ділянки об’єкта будуть мати більш товстий шар напилення, в інших місцях напилення буде відсутній через утворення тіньової зони. Потік електронів в мікроскопі спрямований перпендикулярно до поверхні об’єкта, що забезпечить виявлення світлих і темних ділянок на досліджуваній поверхні, так як в залежності від товщини шару напилення металу ступінь поглинання електронів буде змінюватися.
Електронна мікроскопія зумовила значний прогрес у розвитку цитології. Була описана тонка структура ядра, всіх цитоплазматичних органоїдів: ЕПР, апарату Гольджі, всіляких вакуолей, мітохондрій, пластид, центриолей (рис. 5.1). Саме за допомогою електронної мікроскопії було показано, що двуспіральная молекула ДНК, виділена з бактерій, має форму кільця.
Електронна мікроскопія, в якій зображення будується за допомогою потоку електронів, що проходять через об’єкт, називається трансмісійної. Її роздільна здатність для біологічних об’єктів 2 нм при збільшенні × 100 000, що приблизно відповідає діаметру подвійної спіралі ДНК.
Крім трансмісійної електронної мікроскопії існує растрова (скануюча) електронна мікроскопія, коли зображення будується за допомогою електронного променя, відбитого з поверхні досліджуваного об’єкта. Такі електронні мікроскопи називаються скануючими. У мікроскопі зразок сканується вузьким пучком електронів. Коли промінь електронів потрапляє на зразок, то поверхня зразка, на яку нанесений тонкий шар золота, випускає «вторинні електрони». Вони реєструються приладом і перетворюються у зображення на телевізійному екрані. Максимальна роздільна здатність скануючого мікроскопа менше, ніж трансмісійного, і становить 10 нм для біологічних об’єктів, а збільшення × 20 000. За допомогою скануючих мікроскопів вивчають внутрішні поверхні кровоносних судин, поверхні клітин і невеликих структур. Скануючий мікроскоп дає об’ємне зображення.

...
ПОДІЛИТИСЯ: